Morfologie bakterií

Kvantitativní mikroskopické vyšetření

Metoda je používána pro rychlé orientační zjištění počtu mikroorganismů v tekutých, rozpuštěných nebo, v případě pevných matric, homogenizovaných vzorcích obsahujících větší množství mikroorganismů. Tekuté vzorky se vyšetřují přímo, ostatní se homogenizují v přesně odměřeném množství sterilního fyziologického roztoku v poměru 1:9 nebo 1:99 (tj. 1 + 9 nebo 1 + 99) tak, aby se počet mikroorganismů v zorném poli pohyboval od 10 do 100.

Přesný postup provedení - viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie. Revidované vydání, kapitola 6.2.1. Praktické využití při kvantitativním hodnocení čistých mlékařských kultur - viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení II. Metody stanovení mikroorganismů v potravinách, kapitola 5.2.

Základní kroky:

zhotovení preparátu - na šablonu s vyznačenými čtverci o straně 1 cm se položí čisté odmaštěné podložní sklíčko, mikropipetou se na každý čtverec nanese 0,01 ml vzorku nebo jeho ředění a rovnoměrně se rozetře kličkou na celou plochu čtverce. Po úplném zaschnutí se preparáty fixují trojnásobným protažením sklíčka v plameni. Lze využít také počítací komůrku (např. Bürkerova či Thomova komůrka).

barvení preparátu - preparáty se barví 1-3 minuty roztokem barviva (např. roztokem malachitové zeleně nebo Löfflerovy methylenové modři). Poté se barvivo opatrně opláchuje pod tekoucí vodou tak, aby proud vody nedopadal přímo na preparát. Zbytky vody se z okrajů sklíčka odstraní filtračním papírem a preparát se nechá zaschnout.

odečítání výsledků - preparát se prohlíží v mikroskopu imerzním objektivem za použití imerzního oleje, počítá se počet bakterií v předepsaném počtu zorných polí. Mikrobiální shluky, řetízky a dvojice se pokládají za jednu jednotku. Prohlížíme systematicky na různých místech (meandrovitý pohyb).

výpočet konstanty mikroskopu - na základě zjištěného průměru zorného pole vypočítáme konstantu mikroskopu.

výpočet počtu mikroorganismů - z počtu vyšetřovaných polí a počtu mikroorganismů v nich se vypočte průměrný počet mikrobů v zorném poli. Ten se přepočte na 1 ml vzorku tak, že se násobí faktorem konstantním pro určitou optiku (= konstanta mikroskopu) a stupněm ředění vzorku. Výsledek se vždy zaokrouhlí na dvě číslice různé od nuly (jednotky a desetiny).