Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Základní pojmy
Master mix – reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce.
Reakční směs je složena z:
- koncentrovaného pracovního pufru obsahujícího hořečnaté ionty (ty zajišťují vhodné podmínky pro aktivitu DNA-polymerasy),
- směsi dNTPs,
- DNA-polymerasy,
- specifických primerů,
- PCR vody,
- templátové DNA.
Koncentrace jednotlivých komponent reakční směsi je pro správnou tvorbu PCR produktu velmi důležitá a stanovuje se empiricky.
Templát – DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců; pro reakci PCR se používá DNA o koncentraci přibližně 10 ng/µl.
DNA-polymerasa – enzym používaný k syntéze nové DNA ve směru 5´ → 3´ podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru. Enzym Taq polymerasa, který se nejčastěji pro PCR používá, je izolován z termofilní bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu
dNTP – 2´-deoxyribonukleosid-5´-trifosfátů (adenin, guanin, cytosin a thymin).
Primery – jsou oligonukleotidy (o velikosti obvykle 20-25 bazí), které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a vymezují úsek, který bude amplifikován.