Stanovení Escherichia coli

Charakteristika E. coli

Nejznámějším zástupcem čeledi Enterobacteriaceae a hlavním představitelem koliformních bakterií je Escherichia coli. Jedná se o gramnegativní fakultativně anaerobní krátkou rovnou tyčinku se zaoblenými konci. Většina kmenů E. coli je pohyblivá, některé tvoří slizová pouzdra. Dobře roste na běžných základních půdách, je biochemicky velmi aktivní, až na výjimky zkvašuje laktózu s tvorbou kyseliny a plynu.

E. coli je součástí normální střevní mikroflóry člověka a teplokrevných zvířat, je označována za typickou střevní bakterii. Její výskyt v potravinách a surovinách živočišného původu a v prostředí výrobních podniků je považován za indikátor fekální kontaminace, a tedy nízké úrovně hygieny a sanitačního režimu. Výskyt E. coli v pasterovaných výrobcích svědčí o jejich sekundární kontaminaci. U některých potravin (např. mléčných výrobků) může působit vážné technologické vady a senzorické znehodnocení výrobků. V pitné vodě mají funkci indexových mikroorganismů – indikují možnou přítomnost střevních patogenů, např. salmonel. Některé kmeny E. coli jsou patogenní, mohou působit různě závažná střevní onemocnění, jejich zdrojem mohou být i kontaminované potraviny (např. syrové mléko a maso).

(autor: William Marler, zdroj: http://www.foodpoisonjournal.com/food-poisoning-information/everything-you-wanted-to-know-about-e-coli-but-really-didnt/#.Uk56z1MUI0I)

Stanovení v potravinách

Pro průkaz Escherichia coli v potravinách se využívá selekčního tlaku zvýšené kultivační teploty (44 – 45 °C) a selekčních činidel potlačujících růst grampozitivních bakterií (např. žlučové soli, tergitol či laurylsulfát). Z biochemických vlastností je důležitá schopnost vytvářet z tryptofanu indol a průkaz aktivity enzymu β-D-glukuronidázy.

Aktivita β-D-glukuronidázy se uvádí u asi 95 % kmenů E. coli, může být však prokázán i u malého množství kmenů jiných rodů (např. Enterobacter, Klebsiella, Salmonella). Růst těchto kmenů je inhibován selekčním tlakem žlučových solí a kultivační teplotou 44 °C.

Ke stanovení v potravinách se používá metoda nejvýše pravděpodobného počtu, dále plotnové metody či metoda membránové filtrace.

Současný trend směřuje k používání chromogenních médií. Ke stanovení počtu E. coli se běžně používají půdy s jedním chromogenem pro průkaz β-D-glukuronidázy, který obsahuje modrozelený chromofor.

Dále lze použít půdy s dvěma chromogeny – pro průkaz β-D-glukuronidázy (modrozelený chromofor) a pro průkaz β-D-galaktosidásy (lososově červený chromofor), které umožňují odlišit E. coli (modrofialová – obsahuje oba enzymy), další koliformní bakterie a β-D-glukuronidázonegativní kmeny E. coli (červená – obsahují pouze β-D-galaktosidázu) a další gramnegativní bakterie (bezbarvé – nemají žádný z uvedených enzymů).

Film: Průkaz tvorby indolu a aktivity β-D-glukuronidázy (COLI test)

Princip metody

Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se zalévá selektivní chromogenní živnou půdou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen agar s tryptonem,  žlučovými solemi a glukuronidem  (TBX agar), chromogenní složkou uvedeného agaru je kyselina 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glukuronová (BCIG). Inokulované plotny se inkubují aerobně při 44 °C po dobu 18 – 24 hodin. Z počtu suspektních kolonií vyrostlých na vybraných miskách se vypočte počet β-D-glukuronidázopozitivních Escherichia coli v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Upozornění: Kmeny E. coli nerostoucí při teplotě 44 °C a β-D-glukuronidázonegativní kmeny nejsou touto technikou zachyceny. Jedná se např. o verotoxinogenní sérotyp E. coli O157. Při průkazu těchto kmenů je nutno použít jiný metodický postup.

Pracovní postup

• Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.

• Vzorky očkujeme vždy jinou sterilní pipetou po 1 ml souběžně do dvou sterilních řádně označených Petriho misek.

• Inokulum v každé Petriho misce přelijeme asi 15 ml TBX agaru vytemperovaného na 45 ± 2 °C, důkladně krouživým pohybem promícháme a necháme utuhnout na chladné vodorovné ploše.

• Po ztuhnutí agarové půdy Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 44 °C po dobu 18 – 24 hodin (celková doba inkubace nesmí být delší než 24 hodin).

• Alternativní metoda: Vzorek lze také očkovat roztěrem na povrch TBX agaru, a to 0,2 ml inokula souběžně do dvou řádně označených Petriho misek.

• Upozornění: Je-li podezření na přítomnost stresovaných bakteriálních buněk, inkubujeme misky nejprve po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C a poté při teplotě 44 °C po dobu 18 – 24 hodin. Inkubační teplota nesmí přesáhnout 45 °C.

Hodnocení výsledků a konfirmace

Po ukončení inkubace spočítáme charakteristické kolonie narostlé na každé misce. Pro výpočet použijeme misky obsahující 10 – 150 charakteristických kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Počet β-D-glukuronidázopozitivních Escherichia coli vyjádříme jako počet KTJ v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

Po 18 – 20 hodinách kultivace mají kolonie narostlé na TBX agaru modrou, příp. modrozelenou barvu a průměr 0,5 – 2 mm.

β-D-glukuronidázonegativní kmeny E. coli a další bakterie tvoří bezbarvé kolonie.