Stanovení Enterobacteriaceae

Charakteristika Enterobacteriaceae

Do čeledi Enterobacteriaceae řadíme aerobní a fakultativně anaerobní gramnegativní rovné tyčinky se zaoblenými konci v průměru 2 – 3 μm dlouhé. Pohyblivé druhy mají peritrichální bičíky, některé mají polysacharidová pouzdra. Bakterie z čeledi Enterobacteriaceae fermentují glukózu s tvorbou kyseliny a plynu a vykazují negativní oxidázovou reakci. Další dělení je na základě schopnosti bakterií zkvašovat laktózu; rozlišujeme laktóza pozitivní (koliformní bakterie) a laktóza negativní druhy (např. salmonely, shigely).

Bakterie z čeledi Enterobacteriaceae se vyskytují volně v přírodě, často jsou součástí střevní mikroflóry člověka a teplokrevných živočichů. Z pohledu potravinářského průmyslu se v rámci této čeledě vyskytují mikroorganismy technologicky škodlivé (psychrotrofní bakterie s proteolytickou a lipolytickou aktivitou, např. rody Proteus, Serratia), zdravotně škodlivé (patogenní bakterie, např. salmonely, shigely, některé kmeny E. coli) a mikroorganismy indikátorové.

Stanovení v potravinách

Stanovení bakterií čeledi Enterobacteriaceae je založeno na použití selekčních činidel potlačujících růst grampozitivních bakterií (např. žlučové soli, krystalová violeť, briliantová zeleň), dále indikátorů zkvašování glukózy (indikátor pH, tvorba plynu) a provedení oxidázového testu. Inkubace probíhá aerobně při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin.

Vlastní stanovení se provádí buď s předpomnožením vzorku v tekutém médiu nebo bez předpomnožení, podle očekávaného počtu mikroorganismů se volí metoda nejvýše pravděpodobného počtu nebo plotnová metoda.

Film: průkaz zkvašování glukózy

Film: OXI test

Princip metody

Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se zalévá agarovou živnou půdou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučí a glukózou (VČŽG agar, angl. VRBG agar). Inokulované plotny se inkubují aerobně při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně se provede subkultivace vybraných charakteristických kolonií, jejich biochemická konfirmace a úprava počtu kolonií na miskách podle výsledku konfirmace. Z počtu identifikovaných kolonií na vybraných plotnách se stanoví počet bakterií čeledi Enterobacteriaceae v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Pracovní postup

• Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.

• Vzorky očkujeme vždy jinou sterilní pipetou po 1 ml souběžně do dvou sterilních řádně označených Petriho misek.

• Inokulum v každé Petriho misce přelijeme asi 10 ml VČŽG agaru vytemperovaného na 45 ± 2 °C, důkladně krouživým pohybem promícháme a necháme utuhnout na chladné vodorovné ploše. Předpokládáme-li přítomnost mikroorganismů vytvářejících povlaky, přelijeme po utuhnutí agar na misce asi 15 ml téže půdy (již nemícháme, pouze převrstvíme!).

• Po ztuhnutí agarové půdy Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin.

• Alternativní metoda: provádíme-li stanovení bakterií čeledi Enterobacteriaceae z technologických důvodů (chceme zachytit i psychrotrofní kmeny), volíme pro inkubaci alternativní teplotu 30 °C.

Hodnocení výsledků a konfirmace

Po ukončení inkubace spočítáme charakteristické kolonie narostlé na každé misce. Pro hodnocení použijeme misky obsahující 10 – 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Poté vybereme z každé plotny 5 charakteristických kolonií pro subkultivaci a biochemickou konfirmaci.

Subkultivaci provedeme rozočkováním kolonie na živný agar, který inkubujeme 24 hodin při 37 °C. Následná biochemická konfirmace spočívá v provedení oxidázového testu a zkoušky na fermentaci glukózy s tvorbou plynu.

 Jestliže alespoň 80 % z vybraných charakteristických kolonií dané misky je pozitivně konfirmováno, počet kolonií na misce nijak neupravujeme. V ostatních případech se počet kolonií na misce upraví podle procentuálního podílu pozitivně konfirmovaných kolonií z celkového počtu kolonií vybraných pro konfirmaci. Počet bakterií čeledi Enterobacteriaceae vyjádříme jako počet KTJ v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

Po 24 hodinách kultivace mají kolonie narostlé na VČŽG agaru růžovočervenou, červenou nebo fialovou barvu, velikost 0,5 – 2 mm, mohou být obklopeny růžovou zónou precipitace.