Stanovení enterokoků

Charakteristika enterokoků

Rod Enterococcus (čeleď Enterococcaceae) je reprezentován grampozitivními koky vyskytujícími se ve dvojicích či krátkých řetízcích, které jsou morfologicky velmi podobné streptokokům. Enterokoky se výrazně odlišují schopností růstu v širokém rozmezí teplot a hodnot pH a značnou odolností vůči nepříznivým vnějším podmínkám. Rostou při 10 i 45 °C, v bujónu s 6,5 % NaCl, při pH 9,6 i v přítomnosti 40% žluči či 0,1% methylenové modři. Přežívají záhřev na 60 °C po dobu 30 minut (zvýšená termorezistence). Mezi nejčastější druhy patří Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium.

(autor: Dennis Kunkel Microscopy, zdroj: http://www.corbisimages.com/stock-photo/rights-managed/42-18707894/enterococcus-faecium-bacteria-dividing?popup=1)

Enterokoky se běžně vyskytují jako saprofyté a komenzálové střevního traktu člověka a teplokrevných zvířat. Mimo to se nacházejí v prostředí, zejména fekálně kontaminovaném, dále v povrchových, pitných či odpadních vodách, ale také na rostlinách. Některé kmeny mohou působit onemocnění člověka (např. zánět močových cest, endokarditídy, sepse). Řada kmenů je rezistentních vůči různým antibiotikům.

V praxi nachází stanovení enterokoků uplatnění jako indikátor fekálního znečištění, např. u sušeného mléka. Výskyt enterokoků po pasteraci je citlivým ukazatelem defektů pasteračního režimu a dalších technologických postupů. Jako indikátorové mikroorganismy mohou signalizovat eventuální přítomnost grampozitivních patogenů s podobnou osmo- a termotolerancí, např. stafylokoků a listerií.

Stanovení v potravinách

V potravinách lze enterokoky stanovit kultivačně v tekutých či pevných půdách nebo na membránových filtrech. Obecně je průkaz enterokoků založen na použití selekčních činidel potlačujících růst gramnegativních a ostatních grampozitivních bakterií (např. 40% žluč, azid sodný, octan thalný), dále na průkazu hydrolýzy eskulinu či redukce triphenyl-tetrazolium-chloridu na růžovočervený až červenohnědý formazan.

Ke konfirmaci lze využít agar se žlučí a eskulinem (B-E agar). Na této půdě tvoří kolonie pouze bakterie schopné růstu v prostředí s vysokou koncentrací žluči, hydrolýza eskulinu se projevuje vznikem hnědočerného zbarvení v okolí kolonií.

Princip metody

Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se zalévá selektivně-diagnostickou živnou půdou v Petriho miskách. Pro stanovení enterokoků se běžně používá Slanetz-Bartley agar (S-B agar). Inokulované plotny se inkubují aerobně při 37 °C po dobu 24 – 48 hodin. Z počtu suspektních kolonií vyrostlých na vybraných miskách se vypočte počet enterokoků v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Pracovní postup

• Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.

• Vzorky očkujeme vždy jinou sterilní pipetou po 1 ml souběžně do dvou sterilních řádně označených Petriho misek.

• Inokulum v každé Petriho misce přelijeme asi 15 ml S-B agaru vytemperovaného na 45 ± 2 °C, důkladně krouživým pohybem promícháme a necháme utuhnout na chladné vodorovné ploše.

• Po ztuhnutí agarové půdy Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 24 – 48 hodin.

• Alternativní metoda: Vzorek lze také očkovat roztěrem na povrch S-B agaru, a to 0,2 ml inokula souběžně do dvou řádně označených Petriho misek.

Hodnocení výsledků a konfirmace

Po ukončení inkubace spočítáme charakteristické kolonie narostlé na každé misce. První odečítání provádíme po 24 hodinách, výsledný počet se zjistí po ukončení inkubace, tj. po 48 hodinách. Pro výpočet použijeme misky obsahující 10 – 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. V případě potřeby další konfirmace se vybere 5 kolonií z každé misky a provedou se biochemické identifikační testy. Stanovený počet enterokoků vyjádříme jako počet KTJ v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

Po 48 hodinách kultivace mají kolonie narostlé na S-B agaru červenou až červenohnědou barvu a průměr 0,5 – 2 mm.