Stanovení kvasinek a plísní (aw vyšší než 0,95)

Charakteristika kvasinek

Kvasinky jsou jednobuněčné houby. V přírodě jsou velmi rozšířené, protože mají většinou sacharolytické vlastnosti, vyskytují se především na ovoci a potravinách bohatých na cukry. Rozmnožování kvasinek je podmíněno jejich fyziologickými vlastnostmi, především přítomností cukrů, odolností ke kyselému prostředí a vyššímu osmotickému tlaku. Většina kvasinek se při teplotách nad 40 °C nerozmnožuje, teploty nad 60 °C je ničí.

(zdroj: http://www.trhvin.cz/blogy/19-druhy-zapoceti-fermentace)

Hlavní průmyslový význam kvasinek spočívá v jejich použití pro výrobu alkoholických nápojů (pivo, víno, líh) a pekařského a krmného droždí. Z kvasinek se izoluje řada enzymů, koenzymů, nukleotidů, karotenoidů, atd. V mlékárenském průmyslu se kvasinky uplatňují jako součást čistých mlékařských kultur při výrobě kefírů či sýrů zrajících pod mazem. Svou enzymovou činností způsobují, zejména osmofilní kvasinky, vady a znehodnocení potravin.

Charakteristika plísní

Plísně jsou obecně nenáročné na životní podmínky: jsou schopné využívat vzdušnou vlhkost, a rozmnožovat se za nízké vodní aktivity prostředí, rostou při nízkých teplotách, snáší vyšší osmotické tlaky, rostou v kyselém prostředí. Jsou striktně aerobní a díky širokému enzymovému vybavení – proteolytické, lipolytické a sacharolytické enzymy – jsou schopné využívat různé substráty.

(zdroj: http://www.osetrovatelstvi.eu/index.php/zeh/12-zeh/63-obecna-mikrobiologie)

V přírodě se plísně běžně vyskytují, jejich výskyt v potravinářství je až na malé výjimky, kdy se používají jako čisté kultury při výrobě plísňových sýrů či některých druhů masných výrobků, nežádoucí a působí vady až úplné znehodnocení potravin. Ze zdravotního hlediska jsou plísně v centru pozornosti pro schopnost tvorby termostabilních mykotoxinů, patogenní druhy vyvolávají závažná onemocnění kůže, sliznic i vnitřních orgánů – tzv. mykózy, v neposlední míře může u citlivých osob docházet po aspiraci spór plísní k alergickým reakcím. Pozitivní význam mají plísně jako producenti antibiotik a organických kyselin, dále při přípravě léků či průmyslové produkci enzymů.

Stanovení v potravinách

Stanovení kvasinek a plísní je založeno na použití selektivních činidel potlačujících růst doprovodné bakteriální mikroflóry, nejčastěji se jedná o živné půdy s nízkým pH (např. sladinkový agar), nebo živné půdy s přídavkem antibiotik.

V současné době lze kvasinky a plísně stanovit dvěmi standardními metodami, a to v závislosti na hodnotě aktivity vody (a_w) testovaného výrobku. Tyto metody umožňují pouze stanovení počtu živých kvasinek a plísní, nikoli spor plísní. Také je nelze využít ke stanovení mykotoxinů ve vyšetřovaných potravinách. Inkubace probíhá aerobně při teplotě 25 °C po dobu 5 dní.

Následující kapitoly popisují stanovení kvasinek a plísní v potravinách s aktivitou vody vyšší než 0,95. Jedná se např. o vejce, maso, mléčné výrobky (s výjimkou sušeného mléka), ovoce, zeleninu, čerstvé těstoviny.

Princip metody

Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se roztírá na povrch agarové živné půdy v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen chloramfenikolový agar s dichloranem a bengálskou červení (DRBC agar). Inokulované plotny se inkubují aerobně při 25 °C po dobu 5 dnů. Stanoví se počet kvasinek a/nebo plísní v 1 ml nebo 1 g vzorku z počtu kolonií vyrostlých na vybraných miskách.

Při vyšetření vzorků u kterých hrozí přerůstání půdy bakteriemi (např. syrové maso), se doporučuje použít při přípravě živné půdy kombinaci chloramfenikolu a chlortetracyklinu. Jako ředící roztok při zpracování vzorků je doporučeno používat 0,1% peptonovou vodu, k homogenizaci vzorku peristaltický homogenizátor. Vzhledem k rychlé sedimentaci spór v pipetě se pipeta po naplnění udržuje v horizontální (nikoli vertikální) poloze.

Pracovní postup

• Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.

• Vzorky očkujeme roztěrem na povrch DRBC agaru v Petriho miskách, a to vždy jinou sterilní pipetou po 0,1 ml souběžně na dvě řádně označené misky.

• Inokulované misky necháme zaschnout 15 minut při laboratorní teplotě a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 25 °C po dobu 5 dnů. Misky inkubujeme víčkem vzhůru.
  

• Alternativní metoda: Pro usnadnění stanovení nízkého počtu kvasinek a plísní lze očkovat tekutý vzorek či výchozí ředění pevného vzorku roztěrem po 0,33 ml na 3 Petriho misky (tj. celkem 1 ml inokula).

• Upozornění: Plotny je vhodné inkubovat v otevřeném plastovém sáčku, abychom zabránili kontaminaci termostatu spórami plísní. Některé kvasinky a plísně mohou vyvolat alergické reakce či způsobit onemocnění, proto je při práci s nimi důležitá zvýšená opatrnost. Plotny nenecháváme inkubovat volně při laboratorní teplotě. Víčka misek otevíráme jen v nejnutnějších případech, pracovní stoly a inkubátory pravidelně desinfikujeme.

Hodnocení výsledků a konfirmace

Na každé z ploten spočítáme narostlé kolonie po 2 až 5 dnech inkubace, v případě plísní můžeme inkubaci prodloužit až na 7 dní. Po pěti dnech inkubace vybereme pro stanovení počtu misky obsahující 10 – 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Při rychlém nárůstu plísní vycházíme z počtů zjištěných po dvou a pak znova po pěti dnech inkubace. Při vyšším výskytu plísní je vhodné počet kvasinek odečíst již 3. den, aby nedošlo k jejich přerostení plísněmi. Je-li to potřeba, počítáme kolonie kvasinek a plísní odděleně. Počet kvasinek a/nebo plísní vyjádříme jako počet KTJ v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

Po 5 dnech kultivace jsou kolonie kvasinek na DRBC agaru narůžovělé barvy, okrouhlé, matné nebo lesklé, o průměru 3 – 5 mm, s pravidelným okrajem a více či méně vypouklým povrchem. Charakteristickým znakem je kvasničný zápach a tvarohovitá konzistence kolonií.

Na povrchu DRBC agaru rostou plísně v podobě obrovských (i několik cm) chmýřovitých koloniích často s různě zbarvenými plodícími nebo sporulujícími strukturami (např. bílé, černé, modrozelené, červenooranžové).