Mikrobiologická laboratoř

Základní terminologie

S prací v mikrobiologické laboratoři souvisí následující základní terminologie:

- kultivace – pěstování mikroorganismů na speciálních půdách (agarech, médiích) k tomu určených;

- inkubace – proces, při němž se množí mikroorganismus;

- inokulace (očkování) – aseptické přenesení inokula (živých buněk žádaného druhu) do sterilní živné půdy;

- izolace mikroorganismu – získání čisté kultury určitého mikroorganismu z mikrobiální směsi;

- desinfekce – zničení (devitalizace) patogenních a podmíněně patogenních mikroorganismů účinky vnějšího prostředí;

- asepse – dodržování opatření, které zabraňují kontaminaci a infekci;

- sterilizace – zničení a odstranění všech mikroorganismů (včetně spor) z prostředí např. působením vlhkého nebo suchého tepla;

- kontaminace – znečištění určitého prostředí nežádoucími mikroorganismy.

Provozní místnosti

Provoz mikrobiologické laboratoře vyžaduje oddělené zóny pro:

• příjem, úchovu, úpravu a zpracování vzorků;
• přípravu a sterilizaci kultivačních půd a pomůcek;
• vlastní analýzu, tj. vážení, ředění, inokulaci, inkubaci, subkultivaci, úchovu mikrobiálních kmenů, atd.;
• dekontaminaci, čištění pomůcek a ošetření odpadů vzniklých při mikrobiologickém zkoušení;
• mimo těchto zón doplňují mikrobiologické pracoviště ještě zóny další, např. vstupy, chodby, výtah pro materiál, administrativa, šatny, toalety, sklady.

Aby se zabránilo křížové kontaminaci, musí být některé zóny (např. příjem a úchova vzorků, laboratoř pro manipulaci s patogenními mikroorganismy, varna půd, umývárna laboratorního skla, atd.) prostorově zcela oddělené od ostatních místností.

Stěny, stropy a podlahy musí být hladké, ze snadno čistitelných materiálů odolných vůči detergentům a dezinfekčním prostředkům, okna a dveře vzduchotěsně uzavíratelné. Výměna vzduchu je prováděna přes bakteriologické filtry. Laboratorní stoly a nábytek musí být vyrobeny z hladkého nepropustného materiálu, který je snadno čistitelný a dezinfikovatelný.

V provozních místnostech je pravidelně monitorována mikrobiologická kvalita povrchů a vzduchu, a to např. otiskovou metodou (povrchy) nebo metodou spadovou (ovzduší).

Pracovní boxy

Některé speciální mikrobiologické práce (např. práce s patogeny) vyžadují pracovní boxy (laminární box, flow-box), tj. pracovní stanoviště vybavené horizontálním nebo vertikálním laminárním prouděním vzduchu. Pracovník je oddělen od pracovní části boxu skleněnou přepážkou, do vnitřního prostoru vsune pouze ruce. Laminární box je dále vybaven přívodem plynu, elektřiny a germicidní zářivkou.

Obrázek: Pracovní box (laminární box, flow-box)

Přístrojové vybavení

Přístroje určené pro mikrobiologické pracoviště slouží výhradně pro provádění mikrobiologických rozborů.

K základnímu vybavení laboratoře patří:

• váhy s přesností ±0,01 g
• pH metr
• vodní lázeň s teplotou řízenou termostatem
• mikrovlnná trouba
• homogenizátor (nejčastěji peristaltického typ - tzv. stomacher)
• mechanické míchadlo (vortex)
• optický mikroskop vybavený objektivem s vysokým zvětšením (100x) a olejovou imerzí
• plynový kahan
• sterilizační zařízení - autokláv, horkovzdušný sterilizátor či Kochův parní sterilizátor
• biologické inkubátory (termostaty)
• vybavení pro kultivaci v upravené atmosféře (anaerostaty)
• zařízení k počítání kolonií vybavené osvětlovacím systémem s temným pozadím, lupou a mechanickým nebo digitálním počítadlem;
• chladničky, a to odděleně pro uchovávání: a) neinokulovaných kultivačních půd a reagencií, b) vzorků ke zkoušení, c) mikrobiálních kmenů a naočkovaných půd
• mraznička
• UV germicidní lampa se používá ke sterilizaci prostorů (povrchy) a k likvidaci vzniklých aerosolů v ovzduší laboratoře

Mezi další přístroje používané v mikrobiologické laboratoři patří např. vývěva pro membránovou filtraci, odstředivka, třepačka, transiluminátor a řada dalších.

Homogenizátor, vortex - obrázky

Obrázek: Homogenizátor (stomacher) - vlevo, vortex (míchadlo) - vpravo

Laboratorní pomůcky - 1

Všechny pomůcky určené pro mikrobiologické účely musí být připraveny tak, aby byla až do doby použití zajištěna jejich sterilita.

Základní, běžně používané, laboratorní pomůcky jsou:

• bakteriologická klička
• bakteriologická očkovací jehla
• nástroje k odběru vzorků (pinzety, skalpely, nůžky, lžíce či lžičky)
• hokejky (roztírací tyčinky) - skleněné nebo plastové tyčinky ohnuté do tvaru písmene „L“, používají se k roztírání inokula po povrchu pevného kultivačního média
• skleněné tyčinky
• mikrobiologické zkumavky kryté kovovým víčkem
• Petriho misky
• laboratorní sklo (zejména odměrné válce, Erlenmayerovy baňky, láhve s uzávěrem, kádinky, pipety)
• automatické pipety doplněné vhodnými sterilními plastovými špičkami v autoklávovatelných zásobnících

Laboratorní pomůcky - 2

Mezi další laboratorní pomůcky patří mikroskopická podložní sklíčka, nádobky na barvící roztoky, filtrační aparatura, membránové filtry, šablony, skleněné perly, homogenizační sáčky, nádoby s desinfekcí na odkládání kontaminovaných pomůcek, nádoby na odpad určený k dekontaminaci, atd.

Laboratorní sklo musí být před sterilizací uzavřeno víčkem nebo překryto alobalem. Pinzety, skalpely, nůžky, odběrové tampony, šablony, skleněné pipety, tyčinky, hokejky a další pomůcky sterilizujeme umístěné v odpovídajících nádobách nebo zabalené v alobalu s vyznačením místa otevření. Totéž platí pro jednorázové pomůcky z plastu.

Obrázek: Bakteriologická klička a hokejka

Nejčastější způsoby sterilizace - 1

• Asi nejběžnějším sterilizačním zařízením je autokláv, kde k destrukci mikroorganismů dochází nasycenou parou o teplotě minimálně 121 °C za přetlaku 0,1 MPa, obvyklá doba sterilizace je 15 až 30 minut. Autoklávy se běžně používají ke sterilizaci kultivačních půd a laboratorních pomůcek.

• Další možností je Kochův parní sterilizátor, kde ke sterilizaci dochází v proudící páře, dosahuje se zde teploty maximálně 100 °C, která usmrcuje pouze vegetativní buňky, nikoli spory. Lze ho použít např. k rozváření agarových půd nebo k dekontaminaci naočkovaných kultivačních půd v Petriho miskách či zkumavkách. Kochův parní sterilizátor se používá také k tzv. frakcionované sterilizaci kultivačních médií, která obsahují ingredience nesnášející vyšší teplotu. V Kochově parním sterilizátoru se sterilizují média jako např. VČŽL, VČŽG či XLD

• Při sterilizaci laboratorního skla či kovových pomůcek lze využít horkovzdušný sterilizátor (sušárnu). K destrukci mikroorganismů dochází suchým teplem, proto je nutná vysoká teplota (170 až 180 °C) a delší expozice (minimálně 1 hodinu).

  Tímto zařízením se sterilizuje především laboratorní sklo a pomůcky ze skla či kovu. Lze jej použít také ke sterilizaci vysokovroucích kapalin nemísitelných s vodou (např. parafinový olej), které nelze sterilizovat vodní parou. V žádném případě nelze horkovzdušný sterilizátor používat ke sterilizaci kultivačních médií, membránových filtrů či pomůcek z plastů.

Nejčastější způsoby sterilizace - 2

• Ke sterilizaci reagencií, které nelze autoklávovat, lze využít speciální filtrační zařízení a membránové filtry s velmi malými póry (0,22 μm) schopnými zadržet bakteriální buňky.
• Základním vybavením pracovního místa v mikrobiologické laboratoři je plynový kahan, který se používá k vytvoření a udržení ochranné zóny v okolí hořáku, dále ke sterilizaci kovových očkovacích kliček či jehel žíháním do červeného žáru a k opalování hrdel skleněných zkumavek a nádob.
• K ošetření prostorů a k likvidaci vzniklých aerosolů v ovzduší laboratoře se používají UV germicidní lampy. Nejvyšší účinnosti je dosaženo při použití UV záření o vlnové délce 200 až 280 nm (optimum 260 nm).

Dekontaminace laboratorních pomůcek a vzorků

Všechny použité laboratorní pomůcky musí být před mytím nebo konečnou likvidací dekontaminovány.

• Ihned po použití odkládáme drobné pomůcky (pipety, špičky k automatickým pipetám, hokejky, plastové kličky, nástroje, atd.) do nádob s dezinfekčním roztokem (např. 70% etanol, alkoholové desinfekční prostředky či prostředky na bázi chloru).

• Kontaminované laboratorní sklo včetně skleněných Petriho misek ukládáme zvlášť do označené kovové nádoby a dekontaminujeme sterilizací parou v autoklávu nebo v Kochově sterilizátoru.

• Naočkované plastové Petriho misky či další kontaminovaný jednorázový plastový materiál ukládáme zvlášť do označené kovové nádoby a dekontaminujeme sterilizací parou v autoklávu nebo v Kochově sterilizátoru a jako odpad je dále předáme k odstranění příslušným způsobem.

• K desinfekci kontaminovaných pracovních ploch se používají vhodné desinfekční roztoky (např. 70% etanol).