Kultivace mikroorganismů

Kultivace mikroorganismů

Kultivace je důležitým krokem kvantitativního i kvalitativního průkazu mikroorganismů v potravinách či jiných vzorcích. Některé kultivační techniky se používají při pomnožování mikroorganismů jehož cílem je zisk dostatečného množství buněk pro mikrobiologické, biochemické, genetické či biotechnologické studie nebo pro uchovávání mikroorganismů.

Podstatou kultivace (pěstování) mikroorganismů je přenesení mikroorganismů přítomných v testovaném vzorku (tzv. inokulum) do sterilní živné půdy. Tento postup se označuje jako očkování – inokulace. Při vlastní práci musíme postupovat zcela asepticky, do kultury ani půdy nesmí vniknout žádné cizí mikroorganismy ze vzduchu, pracovních pomůcek či rukou.

Pro kultivaci potřebujeme vhodné sterilní živné půdy, kultivační nádoby, očkovací pomůcky, termostat či temperovaný box, v některých případech i kultivační nádoby umožňující udržování řízené atmosféry.

Přehled kultivačních metod

Tabulka: Přehled základních kultivačních metod

Kvantitativní metody

Cílem kvantitativních metod kultivace je co nejpřesnější stanovení počtu mikroorganismů (všech mikroorganismů, vybraných skupin či určitého druhu) ve vyšetřovaném vzorku. Výsledkem je konkrétní hodnota vyjádřená jako počet KTJ (= kolonie tvořících jednotek, angl. CFU = colony forming unit) v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Rozlišujeme dvě základní metody kultivace mikroorganismů za použití pevných půd, a to metodu zalití a metodu roztěru. Mezi kvantitativní metody patří i metoda MPN, kde je ke kultivaci mikroorganismů použito tekuté živné médium.

Metoda zalití

V rutinní potravinářské praxi se tento způsob inokulace používá nejčastěji. Zvolené ředění vzorku se pipetuje sterilní pipetou souběžně do dvou prázdných, řádně označených Petriho misek, a to v množství 1 ml. Inokulum v Petriho miskách se do 15 minut přelije rozpuštěným agarem vytemperovaným na 45±2 °C v takovém množství, aby se vytvořila vrstva o tloušťce asi 2 – 3 mm. Ihned krouživými pohyby pečlivě promícháme půdu s inokulem tak, aby došlo k rovnoměrnému rozptýlení mikroorganismů ve hmotě půdy. Poté umístíme Petriho misky na chladnou vodorovnou plochu, kde se půda nechá zchladnout a ztuhnout. Ztuhlé misky ukládáme do termostatu dnem vzhůru.

Je-li ve zkoušeném vzorku očekávána přítomnost bakterií tvořících na povrchu média povlaky znemožňující počítání kolonií, přelije se utuhlá první vrstva půdy malým množstvím (asi 5 ml) téže sterilní půdy nebo sterilního agaru, opět o teplotě 45±2 °C. Tím se vytvoří tenká vrstva pokrývající původní povrch a povrchové povlaky se nevytvoří. Opakované přelití se provádí např. v případě zalévání agary VČŽG nebo VČŽL.

Metoda roztěru

V tomto případě se k očkování používají Petriho misky naplněné příslušnou živnou půdou. Inokulum se nanese sterilní pipetou v množství 0,1 ml nebo 0,2 ml (dle použité metodiky) na povrch předsušeného agaru a co nejrychleji se roztírá pomocí sterilní zahnuté tyčinky ze skla nebo plastu (hokejky). Zavřené misky se nechají stát asi 15 minut při laboratorní teplotě, tím dojde k vsáknutí inokula do půdy. Poté se uloží do termostatu dnem vzhůru.

Každé ředění vzorku se dávkuje samostatnou sterilní pipetou souběžně na dvě řádně označené agarové plotny, při roztírání se použije pro každé ředění či vzorek jiná sterilní hokejka.

Metoda MPN

Tento způsob očkování se používá při stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů (metoda MPN – angl. Most Probable Number). Metoda MPN se používá pro stanovení počtu mikroorganismů ve vzorcích, kde se očekává jejich velmi nízký počet. Výsledkem je stanovení hodnoty MPN v 1 ml nebo 1 g vyšetřovaného vzorku.

Sterilní zkumavky se plní obvykle 10 ml sterilní tekuté nebo polotuhé živné půdy. Při stanovení MPN se tekutá půda ve zkumavkách očkuje 1 ml příslušného ředění vzorku či neředěným tekutým vzorkem. Jednotlivá ředění se očkují samostatnými sterilními pipetami paralelně do dvou, tří i více zkumavek dle použité metody.

Série zkumavek naplněných 10 ml živného bujónu se zaočkují 1 ml příslušného ředění vzorku. Podle počtu zkumavek v každé sérii rozlišujeme test třízkumavkový, pětizkumavkový nebo desetizkumavkový. Po inkubaci se u jednotlivých sad spočítají počty zkumavek s viditelným růstem bakterií (zákal, změna barvy média, tvorba plynu apod.), a to se vyhodnotí pomocí statistických tabulek. Výsledkem je stanovení pravděpodobného počtu mikroorganismů (nikoliv kolonií) v 1 ml nebo 1 g vyšetřovaného vzorku.

Kvalitativní metody

Kvalitativní metody kultivace slouží k průkazu přítomnosti či absence konkrétních druhů mikroorganismů ve vyšetřovaných vzorcích.

Kvalitativní průkaz se skládá z pomnožení vzorku v tekutém pomnožovacím médiu a jeho následném vyočkování na pevné selektivní nebo selektivně diagnostické půdy. Výsledkem vyšetření je nárůst charakteristických (suspektních) kolonií, tj. kolonií s morfologií typickou pro daný druh či skupinu mikroorganismů. Posledním krokem kvalitativního vyšetření je konfirmace, tj. potvrzení přítomnosti hledaného mikroorganismu, při které se používají některé speciální kultivační techniky.

Jednostupňová kultivace

Při jednostupňové kultivaci se příslušné množství vyšetřovaného vzorku (obvykle 25 g nebo 25 ml) sterilně vloží do vhodné kultivační nádoby (pevné vzorky do sterilního homogenizačního sáčku, tekuté vzorky do skleněných vzorkovnic).

Vzorek se zalije sterilním pomnožovacím médiem v poměru 1:9; pevné vzorky homogenizujeme, tekuté důkladně promícháme. Množství odebíraného vzorku, kultivačního média i podmínky inkubace (tj. teplota, doba a složení atmosféry) jsou dány příslušnou metodikou.

Po inkubaci provedeme vyočkování sterilní bakteriologickou kličkou nebo skleněnou tyčinkou na povrch vhodné selektivní či selektivně diagnostické pevné půdy a sledujeme nárůst suspektních kolonií. Při výskytu suspektních kolonií stanovovaného mikroorganismu následuje jejich konfirmace.

Příkladem jednostupňové kultivace je pomnožení vzorků v selektivních bujonech při průkazu bakterií r. Campylobacter (bujon podle Boltona), E. coli O157 (modifikovaný bujon TSB + N) či Yersinia enterocolitica.

Dvoustupňová kultivace

Od předešlé metody se liší použitím dvou různých tekutých pomnožovacích půd.

V prvním stupni se kultivace vzorku provádí v neselektivní půdě (tzv. předpomnožení, např. pufrovaná peptonová voda) nebo v půdě se sníženým obsahem inhibitorů (primární pomnožení, např. poloviční bujón podle Frasera). Tento stupeň se zařazuje z důvodů oživení – resuscitace – mikroorganismů, které mohou být částečně poškozeny vlivem technologických procesů při výrobě potravin.

Následuje druhý stupeň, který představuje sekundární (selektivní) pomnožení v tekuté selektivní půdě, kam sterilní pipetou přenášíme předepsané množství předpomnoženého vzorku.

Vyočkování na selektivně diagnostické půdy se provádí ze druhého, případně prvního i druhého stupně. Při výskytu suspektních kolonií stanovovaného mikroorganismu následuje jejich konfirmace.

V případě průkazu salmonel se vzorek pomnožuje nejprve v neselektivním bujonu (pufrovaná peptonová voda), poté v bujonech selektivních (Rappaport Vassiliadis sója médium a Mueller-Kauffman tetrationát novobiocin médium). Při průkazu Listeria monocytogenes se v primárním pomnožení používá poloviční bujon podle Frasera, v sekundárním pak bujon podle Frasera s plným obsahem všech jeho složek. Dále se dvoustupňová kultivace používá např. při průkazu Cronobacter sakazakii a dalších.

Vyočkování na pevnou půdu

Vyočkování pomnoženého vzorku na pevnou půdu provádíme tak, abychom dosáhli co největšího naředění vzorku po povrchu pevné půdy a tím růstu izolovaných, dobře ohraničených kolonií.

Nejčastěji se využívá technika postupného čárkování bakteriologickou kličkou (tzv. křížový roztěr). Tato technika vyžaduje precizní provedení a je poměrně časově náročná.

Druhou možností, využívanou při rutinním zpracování vzorků, je rozočkování skleněnou tyčinkou. Tato technika je mnohem rychlejší, někdy však nemusí být rozředění vzorku dostatečné.

Inkubace - teplota

Růst mikroorganismů v živném médiu je ovlivněn především teplotou, složením kultivační atmosféry, vlhkostí a dobou kultivace.

Teplota

Po zaočkování půdy musíme nechat mikroorganismy inkubovat v termostatech při jejich optimální teplotě růstu. Naočkované Petriho misky kultivujeme převrácené dnem vzhůru, tj. s víčkem na podložce, abychom se vyhnuli stékání zkondenzovaných par z víčka na kulturu. Zkumavky se staví do košíků či stojánků.

Teplota je v termostatu udržována automaticky na zvolené hodnotě odpovídající potřebám stanovované skupiny mikroorganismů, obecně se jedná o následující hodnoty:

- kvasinky 26 – 30 °C (některé rody 18 – 20 °C)

- plísně  25+-1 °C

- mezofilní bakterie 30 – 37 °C

- psychrofilní bakterie 20 °C ale i méně (např. 6 °C)

- termofilní bakterie 50 – 55 °C.

Pro kvalitativní a kvantitativní stanovení mikroorganismů v potravinách je pro každý druh normativně stanovena příslušná teplota kultivace, která se nemusí shodovat s optimální teplotou růstu pro daný mikroorganismus.

Inkubace - vztah ke kyslíku 1

Mikroorganismy se značně liší svými nároky na přítomnost nebo nepřítomnost kyslíku. V závislosti na stupni tolerance vůči molekulárnímu kyslíku je možno mikroorganismy klasifikovat do následujících skupin:

- aerobní mikroorganismy vyžadují pro svůj metabolismus jako konečný akceptor elektronů kyslík (např. rody Pseudomonas, Vibrio, Mycobacterium);

- fakultativně anaerobní mikroorganismy mohou růst v aerobních i anaerobních podmínkách (např. rody Escherichia, Staphylococcus, Bacillus);

- mikroaerofilní mikroorganismy nerostou dobře za přítomnosti vzdušného kyslíku, vyžadují specifické složení atmosféry (např. rody Campylobacter, Lactobacillus);

- anaerobní mikroorganismy vyžadují absenci kyslíku v prostředí, kyslík na ně působí toxicky a odumírají (např. rod Clostridium).

Inkubace - vztah ke kyslíku 2

Aerobní kultivace

Ve většině případů probíhá kultivace za aerobních podmínek, vhodných jak pro aerobní, tak i fakultativně anaerobní mikroorganismy. Tyto mikroorganismy kultivujeme na agarových plotnách či ve zkumavkách, přičemž způsob očkování zalitím nebo roztěrem není rozhodující, protože kyslík difúzí proniká tenkou vrstvou agarové půdy až ke dnu Petriho misky. Při pomnožování mikroorganismů ve větším objemu tekutého živného média je potřeba sytit půdu kyslíkem, což se prakticky provádí třepáním na automatických třepačkách nebo aerací.

Anaerobní a mikroaerofilní kultivace

Mikroaerofilní a anaerobní mikroorganismy rostou za nepřítomnosti nebo snížení tenze vzdušného kyslíku. Toho lze docílit různými způsoby:

- očkováním mikroorganismů vpichem nebo rozmícháním do svislých agarů nebo do vysokých vrstev kapalin o malém povrchu;

- odstraněním kyslíku povařením (tzv. regenerace půdy), půda se těsně před použitím zahřívá 20 min. ve vroucí vodní lázni, ochladí se a zaočkuje. Pro omezení dalšího přístupu vzduchu se půda převrství sterilním parafinových olejem. Při očkování sporotvorných mikroorganismů není potřeba vyvařenou půdu před očkováním zchlazovat, zchladíme ji až po ukončení celého postupu.

- nejčastěji se používá kultivace ve vzduchotěsně uzavřených nádobách s řízenou atmosférou – anaerostatech či anaerobních komorách. Kyslík je z těchto zařízení odstraňován např. chemickou reakcí, kdy snadno oxidovatelné látky rychle spotřebují přítomný kyslík, odčerpáním vývěvou či nahrazením kyslíku jinými plyny (N₂, CO₂, H₂).

Obrázek: Anaerostat s vloženým vyvíječem plynů. Vyvíječ je sáček, ve kterém je po aplikaci vody zahájena chemická reakce spotřebovávající O₂ z atmosféry.

Inkubace - relativní vlhkost a doba kultivace

Relativní vlhkost

Relativní vlhkost má význam zejména při dlouhodobé kultivaci, případně při kultivaci termofilních druhů nebo některých speciálních kultivačních metodách. Nadměrnému vysychání lze předcházet vložením odpařovací misky s vodou do termostatu, dále obalením Petriho misek parafilmem a jejich ukládáním do vlhkých komůrek (uzavřená nádoba, na jejímž dně je kádinka s vodou) nebo zabalením kultivačních nádob do polyetylénových sáčků či fólií.

Doba kultivace

Doba kultivace záleží na stanovované skupině mikroorganismů a použitém druhu živné půdy. Jestliže je nedostatečná, bývají kolonie příliš malé a mohou být přehlédnuty, často také postrádají morfologické vlastnosti typické pro daný druh. V případě diagnostických půd se při zkrácené kultivaci nestačí rozvinout charakteristické indikátorové reakce. Naopak příliš dlouhá kultivace může vést k přerůstání a srůstání kolonií, vysychání půdy a k nežádoucím změnám indikátorových reakcí v diagnostických půdách.

Uchovávání a oživování mikrobiálních kultur - 1

Uchovávání na šikmých agarech

Pro běžnou potřebu uchováváme mikroorganismy ve zkumavkách na šikmých agarech, které ukládáme ve stojáncích či úchovných boxech v chladničkách při teplotě 4 – 6 °C. Mikrobiální kultura na šikmém agaru si zachovává životaschopnost asi po dobu 2 – 6 měsíců, poté dochází k vysychání půdy, postupnému odumírání mikroorganismů a kultury je nutné přeočkovat. Pro přípravu šikmých agarů pro uchovávání bakterií se běžně používají základní půdy (GTK agar, živný agar), v případě kvasinek a plísní např. Sabouradův agar.

Aerobní a fakultativně anaerobní mikroorganismy očkujeme hadovitým pohybem na povrch šikmého agaru. U anaerobních nebo mikroaerofilních bakterií používáme místo očkování na šikmý agar vpich do vysoké vrstvy agarové půdy ve zkumavce. Zátky zkumavek je nutné zaparafinovat či převrstvit narostlé kultury na šikmém agaru sterilním parafinovým olejem tak, aby olej o 1 cm převyšoval horní okraj agaru.

U kultur dlouhodobě uchovávaných na šikmých agarech je vhodné nejdříve provést oživení pasážováním přes neselektivní živné bujóny (masopeptonový bujon, GTK bujon, peptonová voda) a teprve potom vyočkovat kulturu na pevnou půdu.

Uchovávání a oživování mikrobiálních kultur - 2

Lyofilizace

K dlouhodobému uchovávání lze použít také metodu lyofilizace. Suspenze buněk nebo spor v ochranné kapalině bohaté na bílkoviny (bujón, krevní sérum, syrovátka, atd.) se přenese do sterilních ampulek, zmrazí se v lyofilizačním přístroji na -30 až -80 °C a vysuší za vysokého vakua. Pro zachování vakua se ampulky zataví. Během lyofilizace sice dochází k odumření části bakteriálních buněk, avšak přežívající buňky jsou životaschopné po řadu let. Před použitím je nutno lyofilizované kultury oživit pasážováním v tekuté živné půdě za optimálních podmínek.

Uchovávání v zmrazeném stavu

Nejvhodnějším způsobem dlouhodobého uchovávání mikroorganismů je uchovávání v uzavřených mikrozkumavkách v zmrazeném stavu v hlubokomrazících boxech nebo v prostředí tekutého dusíku (-80 °C, respektive -150 až -200 °C). K zamražování lze použít buď komerčně vyráběné úchovné kryobanky s porézními kuličkami a živným médiem (např. ITEST kryobanka) nebo lze přímo v laboratoři připravit uchovávací půdu s glycerolem (20 – 50%) a tu rozplnit do mikrozkumavek se šroubovacím víčkem a sterilizovat.

Sterilní kličkou se nabere 18 – 24hodinová kultura bakterií a opatrně se resuspenduje (o stěnu) v živném médiu v mikrozkumavce. Hustota suspenze by měla odpovídat 3. – 4. stupni McFarlandovy zákalové stupnice. V závislosti od použitého způsobu zamražení a teploty úchovy mohou bakteriální kultury přežívat až několik let. Vyočkování se opět provádí sterilní kličkou, kulička či malé množství glycerinového média se přenese do vhodného tekutého média nebo na pevnou půdu a kultivuje se běžným způsobem.

Obrázek: Způsoby uchovávání mikroorganismů (a – uchovávací půda s glycerolem; b – kryobanka s porézními kuličkami; c – šikmý agar v plastové zkumavce)