Serologické metody
| Stránky: | Moodle Veterinární univerzita Brno |
| Kurz: | Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody 1 |
| Kniha: | Serologické metody |
| Vytiskl(a): | Nepřihlášený host |
| Datum: | pondělí, 25. listopadu 2024, 19.02 |
Popis
Kapitola popisuje vybrané serologické metody využitelné při stanovení mikroorganismů v potravinách.
Serologické metody
Podle charakteru detekovaného antigenu se serologické metody dělí na dva základní typy – aglutinaci a precipitaci. Rozdíl mezi nimi je především ve velikosti detekovaných antigenních částic.
Korpuskulární antigeny (bakterie, kvasinky, latexové částice) jsou dostatečně velké, aby sedimentovaly při centrifugaci 1 000 – 1 200 otáček za minutu a jsou viditelné mikroskopem.
Rozpustné (solubilní) antigeny (bakteriální exotoxiny, enzymy, extrakty mikroorganismů) mají molekulové rozměry. Ze serologických metod se v potravinářské mikrobiologii nejčastěji používají metody na bázi aglutinace.
Každá serologická reakce má 3 základní složky – antigen, protilátku a prostředí (vehikulum). Antiséra obsahující protilátky se připravují injikováním antigenu do pokusného zvířete (např. krysa, králík). Protilátky se získávají z krevního séra po odebrání žilné krve do zkumavky bez protisrážlivých prostředků (po utvoření krevní sraženiny se sérum získá odsátím nebo odstředěním). Vehikulem je nejčastěji fyziologický roztok (0,85% NaCl).
Aglutinace
Aglutinace patří mezi nejběžnější serologické reakce. Princip metody spočívá v tom, že se korpuskulární antigen (bakterie) v přítomnosti specifické protilátky shlukuje – aglutinuje, a vytváří okem viditelné vločky (shluky) – aglutinát.
Podle typu aglutinace rozlišujeme O-aglutinaci, při které se bakterie váží celými těly (reaguje somatický antigen O), nebo H-aglutinaci, kdy se bakterie váží svými bičíky (reaguje flagelární antigen H).
V některých případech může docházet k aglutinaci bakteriální suspenze ve fyziologickém roztoku i bez přítomnosti specifických protilátek, tento jev nazýváme autoaglutinace. Naopak anaglutinabilita je jev, při kterém kapsulární antigen pokrývá povrch somatického antigenu a bakteriální kmen s přidanou protilátkou neaglutinuje.
Aglutinaci můžeme využít dvojím způsobem: a) na určení protilátek v séru pomocí známého antigenu – přímá aglutinace, b) na určení antigenu pomocí známé protilátky – nepřímá (pasivní) aglutinace.
Sklíčková aglutinace
Nejjednodušším formátem je aglutinační reakce prováděná na podložním sklíčku – tzv. sklíčková metoda, kdy po smíchání kapky specifického antiséra s bakteriální suspenzí dojde k vyjasnění původně mléčně zbarvené suspenze a vzniknou viditelné vločky.
Přesný postup provedení je uveden ve skriptech Mikrobiologie potravin - praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie. Revidované vydání, kapitola 13.4.1.
Latexová aglutinace
V některých případech se používá metoda aglutinace na nosičích, kdy se protilátky naváží na indiferentní částice – nosiče (např. latex, bentonit), výhodou takto upravených protilátek je jejich nižší nespecifická reaktivita a lepší vizuální hodnocení výsledků. Provedení je v podstatě shodné se sklíčkovou metodou.
Přesný postup provedení je uveden ve skriptech Mikrobiologie potravin - praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie. Revidované vydání, kapitola 13.4.2.
Reverzní pasivní latexová aglutinace
Při stanovení bakteriálních toxinů se často využívá reverzní pasivní latexová aglutinace (RPLA). Tato metoda patří mezi aglutinace na nosičích (tím jsou zde barevné latexové částice) a provádí v mikrotitračních destičkách, jejichž jamky mají kónické dno. Na rozdíl od klasické aglutinace, jsou při reverzní aglutinaci detekovány solubilní antigeny (bakteriální toxiny). Doba trvání testu je obvykle 18 – 24 hodin. Reakce je hodnocena semikvantitativně podle mřížkové struktury vzniklé na dně jamek destičky, jako pozitivní je hodnocena reakce (+) až (+++).
Vyhodnocení metody RPLA
Využití aglutinačních reakcí
- serologická identifikace a typizace bakterií (např. salmonel, kampylobakterů, patogenních kmenů Escherichia coli)
- průkaz přítomnosti specifických protilátek v krevním séru
- metoda RPLA - průkaz patogenních mikroorganismů a jejich toxinů (např. stafylokokové enterotoxiny, diarhogenní entrotoxiny B. cereus, Shigatoxiny ST1 a ST2) v potravinách.
Precipitace
Precipitace je reakce koloidního rozpustného antigenu – precipitogenu, se specifickou protilátkou – precipitinem, v tekutém nebo gelovém prostředí.
Precipitační testy se používají k průkazu přítomnosti rozpustných antigenů (např. bakteriálních exotoxinů, cizorodých proteinů, virů) nebo ke zjištění titru protilátek proti těmto antigenům.
Rozdíl mezi aglutinací a precipitací spočívá především ve velikosti antigenních částic (precipitogeny jsou menší) a v množství molekul protilátek, které je potřebné k vizualizaci reakce (u precipitace více).
Provedení precipitační reakce:
- ve zkumavkách (prstencový test)
- v agarovém gelu (jednoduchá nebo dvojitá imunodifúze)
Prstencový test
Prstencový test se provádí v precipitačních zkumavkách nebo kapilárách, kdy se do spodní části zkumavky dávkuje těžší složka reakce (sérum) a na ni se opatrně navrství antigen. Při pozitivní reakci vznikne na rozhraní obou složek bělavý prstenec – precipitát, zřetelný proti tmavému pozadí.
Reakce slouží nejen ke kvalitativnímu stanovení, tímto způsobem lze také kvantitativně stanovit titr protilátek či antigenu. Prstencový test se používá například v diagnostice antraxu (Ascoliho reakce).
Vyhodnocení prstencového testu
Imunodifúze
U jednoduché radiální imunodifúze se v agaru pohybuje pouze jedna složka (antigen nebo protilátka) a druhá složka je rovnoměrně rozptýlena v gelu.
Při dvojité imunodifúzi podle Ouchterlonyho difundují proti sobě antigen a protilátka. V místě reakce antigenu a protilátky se vytváří precipitační linie ve formě obloučku, linie či prstence. Metoda je vhodná k identifikaci antigenů a určení jejich imunochemické příbuznosti nebo opačně na důkaz přítomnosti protilátek.
