Metoda ELISA
| Stránky: | Moodle Veterinární univerzita Brno |
| Kurz: | Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody 1 |
| Kniha: | Metoda ELISA |
| Vytiskl(a): | Nepřihlášený host |
| Datum: | pondělí, 25. listopadu 2024, 18.30 |
Popis
Kapitola popisuje metodu ELISA a její využití při stanovení mikroorganismů v potravinách.
ELISA
Společným znakem metod ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) je zakotvení protilátky (adsorpce nebo kovalentní navázání) na nerozpustný nosič (často povrch reakční nádobky nebo mikrotitrační destičky), což usnadňuje separaci imunochemicky navázaných molekul.
Ke značení protilátek se používá enzym (např. alkalická fosfatasa nebo křenová peroxidasa), který katalyzuje přeměnu bezbarvého substrátu na barevný produkt (případně dochází ke změně barvy substrátu). Hodnocení testu je vizuální nebo spektrofotometrické.
ELISA metody umožňují detekci antigenu nebo specifické protilátky, mohou být přímé či nepřímé. V potravinářské mikrobiologii se využívají zejména k detekci antigenu (bakterie, toxin) pomocí známých protilátek.
Nejpoužívanějším typem v komerčních testech je přímá sendvičová (angl. sandwich) ELISA. „Sendvič“ v tomto případě znamená, že je cílový antigen obalen dvěma protilátkami – imobilizovanou protilátkou (vazba antigenu) a enzymaticky značenou detekční protilátkou (tzv. konjugát). Metodu lze využít nejen ke kvalitativnímu, ale i semikvantitativnímu či kvantitativnímu stanovení.
Sandwich ELISA - provedení testu
Vazebné (imobilizované) protilátky jsou navázány na povrch pevného nosiče (např. jamky mikrotitrační destičky). Po přídavku pomnoženého vzorku dojde k vazbě cílových antigenů na protilátky. Následuje opakované promytí, kterým se odstraní zbytky vzorku.
Do jamek se přidá konjugát – detekční enzymaticky značené protilátky, které se váží na cílové antigeny. Několikanásobným promytím se odstraní nenavázané protilátky.
Po přídavku substrátu katalyzuje enzym jeho přeměnu na barevný produkt. Na závěr lze přidat tzv. stop roztok, který ukončí enzymovou aktivitu. Vzniklá barevná reakce je hodnocena vizuálně (podle barevné šablony) nebo spektrofotometricky.
Využití ELISA metod
Metoda ELISA je vysoce specifická imunologická technika používaná k detekci:
- alimentárních patogenů (Salmonella spp., Listeria spp., E. coli O157:H7, Campylobacter spp.)
- bakteriálních toxinů (stafylokokové enterotoxiny, diarhogenní enterotoxiny B. cereus, Shigatoxiny a botulotoxiny).
Je relativně jednoduchá, může být i automatizovaná, výsledky poskytuje dostatečně rychle (obvykle za 2 až 3 hodiny).
Největší využití má při negativním screeningu vzorků (zvýšení počtu vyšetřených vzorků a podstatné zkrácení doby vyšetření). Jedná se však pouze o screeningovou metodu, pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny klasickou metodou, tj. kultivací.