Růst a množení bakterií

Úvod

V příznivých podmínkách vnějšího prostředí (dostatek vody, živin, vhodná teplota, pH, osmotický tlak, atd.) bakteriální buňky intenzivně rostou. Po dosažení určité velikosti dojde k jejich rozdělení na dvě buňky, které po určité době začnou růst a celý cyklus se opakuje. Rychlost růstu bakterií tedy závisí na jejich druhu a genetické výbavě, chemickém složení živného média, fyzikálních faktorech vnějšího prostředí a koncentraci nepostradatelné živiny.

Jako generační dobu označujeme časový úsek od vzniku konkrétní buňky do jejího rozdělení na dvě buňky dceřiné. Dalším pojmem je doba zdvojení (T), která udává dobu potřebnou k tomu, aby se v rostoucí populaci počet buněk zdvojnásobil. Doba zdvojení se může aplikovat i na jiný parametr např. hmotnost biomasy.

Nejkratší dobu zdvojení mají termofilní bakterie (řádově v minutách). Z běžných bakterií patří mezi rychle rostoucí např. Escherichia coli, jejíž doba zdvojení je za optimálních podmínek asi 20 minut. Oproti tomu bakterie rodu Mycobacterium rostou výrazně pomaleji, doba zdvojení je několik hodin až dnů.

Růst a množení bakterií probíhá geometrickou řadou s kvocientem 2, kdy z jedné buňky vzniknou dvě, ze dvou čtyři, atd. Dceřiné buňky vzniklé z jedné mateřské jsou sice shodné, ale ne absolutně. V bakteriální kultuře s vyváženým exponenciálním růstem jsou v daném okamžiku přítomny buňky všech velikostí – nejmenší právě vzniklé, větší v různých fázích růstu i největší nacházející se těsně před rozdělením.

Životní cyklus bakteriální buňky

Životní cyklus bakteriální buňky začíná okamžikem jejího vzniku po rozdělení mateřské buňky a končí jejím rozdělením na dvě buňky dceřiné.

Mezi klíčové děje patří:

• replikace DNA – autoreprodukce genetického materiálu;

• jaderné dělení – prostorové oddělení obou molekul DNA;

• buněčné dělení – rozdělení mateřské buňky na dvě buňky dceřiné.

Replikace bakteriálního chromosomu

Replikace bakteriálního jádra (chromosomu) je podstatně jednodušší než je tomu u eukaryot a probíhá ve třech fázích – iniciace (zahájení) replikace, elongace (vlastní replikace) a terminace (ukončení) replikace. Rychlost replikace, tj. rychlost pohybu replikačního aparátu po molekule DNA, je konstantní. Je nezávislá na rychlosti růstu. Nová replikace může být zahájena ještě před ukončením replikace předcházející.

Replikace začíná vždy ve stejném specifickém místě bakteriálního chromosomu – tzv. replikační počátek neboli „origin“ (místo ori), postupuje obousměrně a končí v místě označovaném jako „terminus“. Replikační počátek je tvořen specifickou sekvencí nukleotidů rozpoznatelnou iniciačními proteiny. Obecně se předpokládá, že iniciace replikace nastává vždy, když je dosaženo určité kritické velikosti bakteriální buňky. Iniciace nastává pravidelně v intervalech rovných generační době. Výsledkem replikace je vznik dvou kruhových molekul DNA, přičemž každá obsahuje jeden původní a jeden nově syntetizovaný řetězec.

Replikace bakteriálního chromosomu - Escherichia coli

(upraveno podle: KAPRÁLEK, F. Základy bakteriologie. 1. vyd. Praha, ČR: Univerzita Karlova v Praze, Nakladatelství Karolinum. 2000. 241 p.)

Replikace bakteriálního chromosomu

Oba řetězce DNA jsou pevně spojeny vodíkovými můstky mezi komplementárními nukleotidy. K rozrušení vodíkových můstků dochází při replikaci působením iniciačních proteinů.

Oddálením obou řetězců DNA se vytvoří tzv. replikační vidlice. Z nich dochází k rozplétání dvojšroubovice DNA a současně k syntéze nového řetězce. Mezi zúčastněné enzymy patří helikasy (rozplétají obě vlákna DNA) a topoisomerasy (uvolňují vznikající napětí v molekule DNA). Do skupiny topoisomeras patří i tzv. gyrasy, které odstraňují nadbytečné závity vznikající během replikace. DNA-polymerasa syntetizuje DNA pouze jedním směrem, a to od konce 5´ ke konci 3´. Toto vlákno je označováno jako vedoucí a je syntetizováno průběžně. Druhé, tzv. zaostávající vlákno, je syntetizováno v podobě krátkých Okazakiho fragmentů, které jsou následně pospojovány enzymem ligasou. Případné vzniklé chyby odstraňuje přímo DNA-polymerasa nebo jiný opravný systém. Replikace končí syntézou terminačních proteinů.

Syntéza vedoucího a zaostávajícího řetězce při replikaci bakteriálního chromosomu

Protože je bakteriální chromosom připoután svým počátkem k cytoplasmatické membráně a buněčné stěně, k prostorovému oddělení mateřského a dceřiného chromosomu dochází růstem membrány a stěny mezi místy přichycení rodičovských vláken obou chromosomů.

Rozdělení buňky

Pokud proběhlo jaderné dělení a bakteriální buňka dosáhla kritické velikosti, dochází k buněčnému dělení. Většina bakterií se dělí příčně za vzniku dvou stejně velkých, ale fyziologicky ne zcela identických buněk. Asymetrické dělení pozorujeme např. u pučících bakterií (dceřiná buňka neboli pupen má zpočátku malé rozměry, postupně dorůstá a zůstává spojena s mateřskou úzkým krčkem); u aktinomycet se příčná přepážka tvoří nepravidelně, buňky se větví či tvoří vlákna.

Rozdělení buňky je umožněno tvorbou příčného septa, které se tvoří od obvodu buňky (obvykle v ekvatoriální rovině) a roste směrem do jejího středu. Septum fyzicky rozpůlí mateřskou buňku na dvě buňky dceřiné. Dceřiné buňky se mohou zcela oddělit nebo zůstávají spojeny extracelulární hmotou či společnou pochvou do různých útvarů (dvojice, řetízky, shluky, atd.). U grampozitivních mikroorganismů při tvorbě přepážky nedochází k zaškrcení (konstrikci) buněk, u gramnegativních obvykle ano.

Oblasti vzniku nové buněčné stěny se označují jako stěnové pásy. V jejich místě dochází k hromadění prekurzorů buněčné stěny. Tvorba septa začíná invaginací (vchlípením) cytoplasmatické membrány. Její růst je následován rozrůstáním vrstvy peptidoglykanu do prostoru mezi membrány. Nově syntetizovaná buněčná stěna se současně vysunuje na obě strany (buňka se protahuje) a vrůstá dovnitř buňky. Současně se syntézou peptidoglykanu působí i lytické enzymy (autolysiny) umožňující štěpení původní buněčné stěny a vytvoření prostoru pro začlenění nových molekul. Aktivita syntetizujících i lytických enzymů je v rovnováze.

Růstová křivka bakteriální populace

Při jednorázové (statické) kultivaci čisté kultury bakterií v tekutém živném médiu obsahujícím nadbytek potřebných živin, dochází postupně k nárůstu bakteriální biomasy. Grafické vyjádření koncentrace biomasy (nebo počtu bakteriálních buněk) v závislosti na čase se označuje jako růstová křivka bakteriální populace. Růstová křivka má 4 základní fáze (lag-fázi, exponenciální fázi, stacionární fázi a fázi odumírání), které doplňují fáze přechodové, umožňující plynulý a postupný přechod z jedné hlavní fáze do druhé.

Lag-fáze (angl. lag – zpoždění, průtah) je charakterizována adaptací bakterií na prostředí živného média, počet bakterií zůstává konstantní. V této fázi se klidové nerostoucí buňky postupně mění na buňky aktivně rostoucí, případné spory klíčí a přeměňují se na vegetativní buňky. V této fázi nedochází k dělení buněk. Délka lag-fáze závisí na druhu bakterií, fyziologickém stavu buněk, velikosti inokula (nepřímá úměra) a složení růstového média.

Lag-fáze přechází do krátkého období, kdy se buňky začínají dělit, ale ne stálou rychlostí (tzv. fáze zrychleného růstu). Následuje fáze exponenciální (logaritmická), pro kterou je charakteristický intenzivní a pravidelný růst, dělení buněk probíhá konstantní rychlostí. Bakteriální populace se množí dvojnásobnou geometrickou řadou, doba zdvojení je konstantní.

Po určité době dochází k fázi zpomalení růstu, která umožňuje plynulý přechod exponenciální fáze do fáze stacionární. Příčinou může být buď vyčerpání limitující živiny nebo nahromadění toxických zplodin metabolismu. Ve stacionární fázi růst a množení bakterií ustává, počet bakterií je po určitou dobu konstantní.

Stacionární fáze přechází ve fázi odumírání, kdy hladovějící živé bakterie nerostou, postupně hynou a jejich koncentrace v závislosti na čase klesá. Přechodná fáze se v tomto případě označuje jako fáze poklesu.

Jednorázová (statická) kultivace

(zdroj: VOTAVA, M. Lékařská mikrobiologie obecná. 1. vyd. Brno, ČR: Neptun. 2001. 247 p.)

Diauxie

Zvláštním typem růstové křivky je tzv. diauxie (dvojitá růstová křivka neboli „dvojrůst“), což je v podstatě křivka složená ze dvou růstových křivek oddělených časovou prodlevou. Její tvorbu můžeme pozorovat v případě, že živné médium obsahuje dvě různé živiny se stejnou fyziologickou funkcí, např. dva různé cukry.

Může nastat situace, kdy první cukr inhibuje adaptaci buňky na cukr druhý. Jinými slovy, bakteriální buňka díky svému kontrolnímu mechanismu vyloučí utilizaci jednoho cukru jako nadbytečný a ekonomicky nevýhodný proces. Druhý cukr je potom využíván až po vyčerpání toho prvního. Prakticky dochází k tomu, že se bakteriální buňky po skončení logaritmické fáze, dostávají zpět do lag-fáze, během které syntetizují nové enzymy schopné utilizovat druhý substrát. Tento fenomén není omezen pouze na cukry, ale platí i pro jiné živiny.

Příklad diauxie u Escherichia coli

(zdroj: ROSYPAL, S., HOĎÁK, K., MARTINEC, T., KOCUR, M. Obecná bakteriologie. 1. vyd. Praha, ČR: Státní pedagogické nakladatelství v Praze. 1981. 749 p.)

Kontinuální kultivace bakterií

Nejen v průmyslové mikrobiologii se často využívá kontinuální kultivace – systém v němž jsou do rostoucí kultury bakterií nepřetržitě dodávány potřebné živiny a část kultury současně odtéká, v případě potřeby dochází i k provzdušňování živného média. Díky tomu může být bakteriální populace udržována v exponenciální fázi po neomezeně dlouhou dobu. Systém může být koncipován jako otevřený či uzavřený, v obou případech potom jako homogenní či heterogenní. Technické uspořádání může být velmi rozdílné.

Základním typem je tzv. fermentor – otevřený homogenní jednostupňový systém představovaný kultivační nádobou s míchadlem a přívodem vzduchu, do které neustále ze zásobníku přitéká čerstvé médium a současně stejné množství kultury odtéká pryč.

V případě turbidostatu je kultivační nádoba vybavena čidlem pro měření koncentrace bakterií. Po překročení zvolené koncentrace dojde k zapnutí ventilu ovládajícího přítok čerstvého média. V chemostatu probíhá kultivace zpočátku jako jednorázová, po vyčerpání limitující živiny je zahájen přítok čerstvého živného média, a to takovou rychlostí, že se kultura sama dostane do ustáleného stavu.

chemostat

(zdroj: http://biology.mcgill.ca/faculty/fussmann/slideShow/chemostatDetail.html)

Růst v podobě biofilmu

Jako planktonický růst označujeme růst bakterií v podobě izolovaných buněk.

Druhou formou je růst v podobě biofilmu, který se často vyskytuje v přirozených podmínkách (slizké povlaky na povrchu předmětů ve vlhkém prostředí).

Biofilm je definován jako strukturované mikrobiální společenství, uložené v mezibuněčné hmotě a adherující k inertním i živým povrchům. Biofilmy představují vyšší a složitější způsob života mikroorganismů, mohou být tvořeny jedním nebo více druhy (např. Enterococcus spp., Listeria monocytogenes, Salmonella spp.). Oproti planktonických formám zde pozorujeme výrazně úspěšnější horizontální přenos genů, např. genů rezistence.

Mikrobiální buňky v biofilmu jsou vysoce odolné k zevním vlivům – vysychání, napadení bakteriofágy, účinku toxických či desinfekčních látek, atd. V makroorganismu jsou buňky v biofilmu chráněny proti účinku makrofágů, protilátek či antibiotik (chronické infekce).

Biofilm má trojrozměrnou stavbu. Základní strukturní jednotkou jsou mikrokolonie bakterií, které jsou obklopeny slizovitou mezibuněčnou matrix. Složitá struktura biofilmu obsahuje volné, poměrně široké prostory či kanálky, kterými proudí voda přinášející živiny a odvádějící zplodiny metabolismu. Tvar biofilmu je dynamický.

Tvorba biofilmu

Tvorba biofilmu je poměrně pomalý proces. Začíná adhezí bakterií na vhodný povrch s následnou produkcí tenkých polysacharidových vláken. Postupně se formují mikrokolonie a vytváří se struktura biofilmu (kanálky, póry). Ireverzibilně spojené bakteriální buňky rostou a dělí se, mikrokolonie se zvětšují a spojují se do vrstvy buněk pokrývající povrch. Další nárůst biofilmu se uskutečňuje nánosem nebo zapojením dalších organických nebo anorganických látek z okolní kapalné fáze. Při stárnutí biofilmu dochází k oddělení bakterií z jeho povrchu a jejich rozptýlení, což může vést ke kolonizaci nových míst.

Schéma tvorby biofilmu

(upraveno podle: SCHINDLER, J. Mikrobiální biofilm. Vesmír, 2001, roč. 80, č. 4, s. 203-206.)

Význam biofilmů

Velký význam mají biofilmy v medicíně, kdy je nacházíme v zubním plaku, na dásních či ve zvukovodu. Nežádoucí je tvorba biofilmů na intravenózních katetrech, umělých srdečních chlopních, kloubních náhradách, atd.

V potravinářském průmyslu se biofilmy tvoří na povrchu výrobních zařízení (potrubí, podlahy, hadice odpadních vod, ohyby hadic, ventily, defekty a nerovnosti vnitřních povrchů), příp. i povrchu potravin.

Biofilmy jsou obecně obtížně odstranitelné, proto je třeba klást důraz na výběr materiálu pro vybavení a zařízení provozů, jejich správnou konstrukci a kvalitu a hladkost zařízení. Nezbytná je správná sanitace povrchů (účinný sanitační program, volba vhodných detergentů a desinfekčních látek a kontrola účinnosti sanitačního procesu) s případným využitím bakteriocinů a bakteriálních enzymů.