Metoda ELFA

ELFA

Fluorescenční imunologická metoda ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay) je automatizovaná metoda prováděná na přístroji VIDAS^®. Princip reakce je podobný jako u metody ELISA, rozdíl je v použitém substrátu, který je enzymem štěpen na fluorescenční produkt. Vzniklé chemické změny (fluorescence) jsou detekovány pomocí fotodiodového fluorimetru.

Vlastní test se skládá ze dvou částí – komůrky s pevnou fází (SPR^®), která je běžně označovaná jako „špička“ a její vnitřní povrch je potažen specifickou protilátkou pro hledaný antigen, a reagenčního stripu, v jehož jamkách jsou promývací a reagenční roztoky potřebné pro provedení testu.

Jednotlivé kroky reakce jsou shodné s provedením sendvičové ELISA metody, tj. vazba antigenů na imobilizované protilátky v SPR^®, opakované promytí, vazba konjugátu (tvorba komplexu imobilizovaná protilátka-antigen-konjugát), opakované promytí, přídavek substrátu a výsledná enzymatická reakce.

Provedení testu

Po pomnožení vzorku je tento tepelně ošetřen a příslušné množství je odměřeno do první komůrky reakčního stripu, který se následně spolu se špičkou (SPR^® fáze) umístí do přístroje. Po spuštění přístroje se SPR^® postupně zasunuje do jamek s reagenciemi. Ty jsou nasáty do špičky a po ukončení daného kroku opět vypuštěny do příslušné jamky stripu.

V závěru analýzy je SPR^®, obsahující v případě pozitivního výsledku komplex imobilizovaná protilátka-antigen-konjugát, naplněna fluorogenním substrátem (4–methyl-umbelliferyl fosfát na 4-methyl-umbelliferon) z poslední jamky - optické kyvety. Proběhne enzymatická reakce a obsah je uvolněn zpět do optické kyvety, kde je změřena hladina fluorescence (tzv. relativní fluorescenční hodnota, RFV). Hodnota RFV se porovná s interními referenčními hodnotami a provede se interpretace výsledků (pozitivní/negativní). Výsledky pro jednotlivé vzorky přístroj vytiskne. Doba stanovení je 48 – 90 minut, podle typu testu.

Schéma ELFA metody

(upraveno podle: MCMEEKIN, T.A. (ed.) Detecting pathogens in food. 1^st ed. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. 2003. 384 p.)

Interpretace výsledků

Fluorescence je pro každý vzorek měřena dvakrát:

• první odečet je pozadí (předtím, než je SPR vložen do substrátu)

• druhý odečet je proveden po kontaktu substrátu s enzymy (SPR)

Odečtením hodnoty pozadí od hodnoty výsledku je spočtena hodnota RFV (Relative Fluorescence Value).

Využití metody ELFA v praxi

Přístroj VIDAS^® má široké využití v klinické mikrobiologii, např. při vyšetření na hepatitidu, AIDS, alergie, anémie, hormony štítné žlázy.

V potravinářské mikrobiologii je využíván při detekci Listeria spp., Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Campylobacter spp. a stafylokokových enterotoxinů typu A – E.

Provedení testu - video