Bakteriální spory

Bakteriální spory

Některé grampozitivní bakterie, např. rody Bacillus a Clostridium, mohou za nepříznivých podmínek vytvářet klidová stádia – spory (endospory), které mají prakticky nulový metabolismus a jsou extrémně odolné. Každá bakterie je schopna vytvořit uvnitř své buňky vždy jen jednu endosporu. Spory aktinomycet nejsou endosporami, protože se tvoří na konci vlákna a vzniká jich větší počet.

Extrémní odolnost spor vůči podmínkám zevního prostředí je dána hned několika faktory: stabilizací makromolekul, ztrátou vody a její náhradou v polymerech vápníkem. Jako spory mohou bakterie přežívat i řadu let. Spory jsou vysoce odolné k vysychání, vysoké teplotě (např. spory C. botulinum přežívají až pětihodinový var), mražení, pH, UV záření, do jisté míry i radiačnímu záření, řadě desinfekčních prostředků, atd.

Termorezistenci spor zvyšuje přítomnost organických látek – bílkovin, lipidů a vyšších koncentrací sacharidů, které mají ochranný efekt. Oproti tomu kyselé pH termorezistenci spor snižuje. Málo kyselé a nekyselé potraviny proto sterilujeme teplotami nad 100 °C, výrazně kyselé potraviny (pH pod 4,0) stačí zahřívat na teplotu 85 až 100 °C, protože přežívající spory bakterií nemohou v kyselém prostředí vyklíčit, tzn. přeměnit se ve vegetativní buňku, pomnožit se a potravinu znehodnotit.

Na spory vůbec nepůsobí ethanol, deriváty fenolu či povrchově aktivní látky. Spolehlivé sporocidní účinky mají např. ethylenoxid, koncentrované louhy a kyseliny či kyselina peroctová (Persteril). Spory ničí autoklávování, tj. působení vodní páry za zvýšeného tlaku, a to minimálně 20 minut při teplotě 121 °C a přetlaku 0,2 MPa.

Morfologie bakteriálních spor

Pod mikroskopem vyhlíží spory jako vysoce světlolomné útvary, které nepřijímají Gramovo barvení. Lze je obarvit speciálními barvicími postupy, např. barvením za horka.

Tvar, relativní velikost a uložení spor jsou často typické pro různé druhy sporulujících bakterií, čehož lze využít k jejich identifikaci. Spory jsou většinou oválné, méně často kulaté (kulaté spory má např. C. tetani). Pro řadu bakterií rodu Clostridium je typické, že průměr spory je větší než průměr vegetativní buňky a proto dochází k jejímu vyklenutí neboli zduření (spora buňku tzv. „bubří“), u bakterií rodu Bacillus k duření buňky obvykle nedochází. Spory mohou být v bakteriální buňce uloženy buď centrálně (uprostřed), terminálně (na konci) nebo subterminálně či paracentrálně (mezi středem a pólem buňky).

Tvorba spor - sporulace

Proces tvorby spor se označuje jako sporulace. Sporulace nastává při poklesu živin pod určitou hodnotu, obvykle na konci exponenciální fáze růstu, a trvá asi 10 hodin.

Vlastní proces sporulace lze rozdělit do sedmi navazujících morfologických stadií:

• stadium 0: výchozím bodem je vegetativní buňka

• stadium I: mění se morfologie jádra, dochází k replikaci chromosomu, původně kruhový chromosom se linearizuje a oba chromosomy jsou spojeny v jediné podélně umístěné vlákno;

• stadium II: pro toto stadium je charakteristické rozdělení jádra následované rozdělením buňky sporovým septem na dvě nestejně velké části. Sporové septum je dvouvrstvá struktura, která vzniká vychlípením cytoplasmatické membrány směrem do nitra buňky. Uzavřením septa se cytoplasma původní mateřské buňky (tzv. sporangia) oddělí od prostředí budoucí spory, které obsahuje chromosom, ribosomy, enzymy, zásobní látky a další složky.

• stadium III: v průběhu tohoto stadia putuje budoucí spora dovnitř mateřské buňky za současného prodlužování septa směrem k pólu buňky, čímž se vytvoří vnitřní a vnější membrána spory. Na konci této fáze vzniká tedy uvnitř mateřské buňky samostatná buňka obdaná dvojitou membránou, tzv. prespora. Prespora je barvitelná a citlivá k nepříznivým podmínkám prostředí. Od tohoto okamžiku je proces sporulace již nevratný.

Tvorba spor - sporulace

• stadium IV: v následujících stadiích dochází ke tvorbě obalových vrstev spory, nejprve se mezi vnitřní a vnější membránou začne tvořit silná vrstva zvaná kortex (peptidoglykan specifické stavby). Nejprve se tvoří jeho vnitřní vrstva, tzv. sporová stěna, jejíž stavba je shodná s peptidoglykanem buněčné stěny a ze které při klíčení vznikne buněčná stěna nové vegetativní buňky. Potom se vytvoří vnější silnější vrstva specifického peptidoglykanu kortexu. Začíná se tvořit kyselina dipikolinová a ukládat vápník. Spora se poprvé jeví jako světlolomná.

• stadium V: v tomto stadiu se nad vnější membránou vytvoří plášť spory – několik vrstev bílkovinné povahy obsahujících velké množství sirné aminokyseliny cystinu. Současně pokračuje syntéza kyseliny dipikolinové a ukládání vápenatých iontů.

• stadium VI: v průběhu zrání získává spora své typické vlastnosti – světlolomnost, dehydrataci (spora obsahuje pouze 15 % vody) a odolnost vůči chemickému a fyzikálnímu poškození. Pro sporu je charakteristický obsah dipikolinátu vápenatého (kyselina dipikolinová ve vegetativních buňkách chybí). Nízký obsah vody a přítomnost dipikolinátu vápenatého jsou příčinou vysoké termorezistence spor.

• stadium VII: dochází k lýzi mateřské buňky a uvolnění spory do prostředí.

U některých druhů se na povrchu spory vytvoří ještě další volná blána, tzv. exosporium, které mívá charakteristický tvar (např. exosporium B. cereus tvoří na koncích spory křídla). Exosporium se začíná tvořit od III. stadia sporulace.

Tvorba spor - sporulace

Mezi nejvýznamnější fyziologické změny patří: vznik molekul a struktur, které se nevyskytují ve vegetativní buňce (kyselina dipikolinová, peptidoglykan kortexu, bílkoviny sporového pláště), zvýšení aktivity enzymů Krebsova cyklu a rychlosti produkce energie aerobní respirací, tvorba hydrolytických enzymů, hromadění vápníku a dehydratace.

Energii nezbytnou pro syntézu povrchových struktur spory získává bakteriální buňka oxidací poly-ß-hydroxymáselné kyseliny (zralé spory ji nemají). U aerobních bakterií je pro sporulaci nezbytná přítomnost kyslíku, u anaerobních kyslík sporulaci inhibuje.

Průřez bakteriální sporou

Dormantní (klidová) spora je tvořena protoplastem obdaným vnitřní membránou, kortexem, vnější membránou, několikavrstevným pláštěm a případně i exosporiem. Má téměř nulový obsah volné vody a neměřitelný metabolismus.

Klíčení spor - germinace

Germinace neboli klíčení bakteriální spory je proces její přeměny ve vegetativní buňku schopnou dalšího rozmnožování. Nastává po přenesení spory do vhodných fyzikálně-chemických podmínek pro růst a množení (dostatek vody a živin, vhodné pH a teplota). Celý proces má tři fáze – aktivaci, vlastní klíčení a fázi diferenciační.

Aktivace spory spočívá v porušení nepropustného sporového pláště. Aktivačním zásahem je mechanický oděr, zvýšená teplota, nízké pH, atd. Přirozeným způsobem aktivace je i stárnutí spory. V laboratoři můžeme aktivaci spory navodit mírným záhřevem v přítomnosti vody.

Vlastní klíčení (germinace) je irreverzibilní a metabolický proces. V přítomnosti vody a živin dochází k rozpadu kortexu a uvolnění sporového protoplastu. Aktivovaná spora začne přijímat vodu, tím ztrácí svoji rezistenci a bílkoviny, které v ní vznikly jako stabilizátory, se začínají rozkládat enzymy přítomnými v dormantní (klidové) spoře. Do prostředí se uvolňuje dipikolinát vápenatý, do buňky vstupuje voda, různé ionty (např. K⁺, Mg²⁺) a molekuly. V průběhu klíčení mizí termorezistence i světlolomnost. Tato fáze probíhá velmi rychle (asi 1 minutu).

V diferenciační fázi se ze vzniklých aminokyselin syntetizují nové proteiny. Sporový protoplast je přestavěn ve vegetativní buňku. Celý proces klíčení končí prvním buněčným dělením bakteriální buňky.