Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Úvod

V osmdesátých letech 20. století byla vynalezena nová, rychlá a účinná metoda pro klonování DNA – polymerázová řetězová reakce (PCR, angl. Polymerase Chain Reaction).

Tato metoda se stala základem pro mnoho dalších genotypových metod. Pomocí PCR můžeme rychle a vysoce selektivně namnožit konkrétní nukleotidové sekvence obsažené v jakékoli DNA (deoxyribonukleové kyselině) za podmínek in vitro.

Princip PCR

Principem PCR je opakované kopírování (amplifikace) templátové (vzorové) molekuly DNA pomocí enzymu DNA-polymerasy.

Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy (primery), které nasedají na templátovou DNA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu. Každý primer reaguje s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA

Schéma amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce. (ALBERTS, B., BRAY, D.; JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P. (eds.) Základy buněčné biologie (Úvod do molekulární biologie). 1. vyd. Ústí nad Labem, CZ: Espero Publishing, s.r.o. 2005. 630 s.)

Základní kroky reakce

Mnohonásobné amplifikace (tzn. namnožení DNA) je dosaženo opakováním tří základních kroků – denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken.

1) Při denaturaci templátové DNA (obvykle při teplotě 95 °C) dochází k uvolnění vodíkových můstků mezi bázemi komplementárních nukleotidů a k přechodu dvouřetězcové šroubovice DNA (dsDNA) na jednořetězcovou (ssDNA).

2) Při kroku hybridizace se reakční směs nejprve ochladí (teplota kolem 50 – 60 °C). V tomto kroku jsou na specifická místa navázány komplementární primery (tzv. annealing primerů) Zabrání vzniku původní dvoušroubovice a ohraničí amplifikovaný úsek DNA z obou stran.

3) Za přítomnosti DNA-polymerasy a základních stavebních kamenů DNA –nukleosidtrifosfátů (dNTP) je obvykle při teplotě 72 °C zahájen proces prodlužování nového vlákna DNA podle templátu (původní DNA). Tato fáze se nazývá syntéza nebo elongace.

Termocykler

Pro nasyntetizování dostatečného množství PCR produktu se zmíněné kroky 25 – 35× opakují.

Celý proces amplifikace probíhá v termocykleru – přístroji, který umožňuje nastavení cyklického střídání teplot v reakční směsi v přesně definovaných časových intervalech.

Základní pojmy

Master mix – reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce.

Reakční směs je složena z:

• koncentrovaného pracovního pufru obsahujícího hořečnaté ionty (ty zajišťují vhodné podmínky pro aktivitu DNA-polymerasy),
• směsi dNTPs,
• DNA-polymerasy,
• specifických primerů,
• PCR vody,
• templátové DNA.

Koncentrace jednotlivých komponent reakční směsi je pro správnou tvorbu PCR produktu velmi důležitá a stanovuje se empiricky.

Templát – DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců; pro reakci PCR se používá DNA o koncentraci přibližně 10 ng/µl.

DNA-polymerasa – enzym používaný k syntéze nové DNA ve směru 5´ → 3´ podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru. Enzym Taq polymerasa, který se nejčastěji pro PCR používá, je izolován z termofilní bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 °C, enzym zůstává aktivní při této teplotě až 40 minut.

dNTP – 2´-deoxyribonukleosid-5´-trifosfátů (adenin, guanin, cytosin a thymin).

Primery – jsou oligonukleotidy (o velikosti obvykle 20-25 bazí), které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a vymezují úsek, který bude amplifikován.

Příprava reakční směsi

Všechny komponenty pro přípravu PCR směsi (master mixu) je vždy třeba před použitím jemně promíchat a krátce odstředit při nízkých otáčkách na pikofuze.

Jako první pipetujeme vodu, reakční pufr a ostatní komponenty – primery, dNTP, MgCl₂, Taq polymerasu do ní postupně přidáváme. Jako poslední se přidá templátová DNA.

Pro rutinní provádění PCR jsou k dispozici komerčně předpřipravené reakční směsi.

Při vyšetřovaní většího množství vzorků si můžeme PCR reakční směs připravit najednou smícháním všech komponent (kromě templátové DNA) v mikrozkumavce typu Eppendorf. Obsah promícháme a krátce odstředíme a rozplníme do předem označených PCR mikrozkumavek po požadovaném množství pro jednu reakci. Po rozplnění přidáme potřebné množství templátové DNA daného vzorku (obvykle 1 – 2 μl). Obsah opět promícháme a krátce odstředíme.

Takto připravené mikrozkumavky vkládáme do termocykleru.

Laminární box

Aby nedocházelo ke kontaminacím a zkresleným výsledkům, připravuje se reakční směs ze všech komponent (kromě templátové DNA) v laminárním boxu.

Systém kontrol PCR reakce

Správný průběh reakce se prověřuje použitím několika systémů kontrol.

Pozitivní a negativní kontrola je pro sérii vzorků, interní kontrola pro individuální vzorky. Dále je nezbytné kontrolovat i proces izolace DNA – tzv. negativní izolační kontrola.

Negativní kontrola – reakční směs + PCR voda či DNA získaná z buněk jiného rodu bakterií, než testujeme. Tato kontrola slouží jako indikátor, že žádná z komponent použitých pro master mix nebyla kontaminována a že celý proces reakce včetně detekce proběhl správně.

Pozitivní kontrola – reakční směs + DNA získaná z buněk stejného rodu bakterií, jež testujeme, např. sbírkového kmenu. Tato kontrola slouží jako indikátor, že celá reakce proběhla správně a že všechny použité komponenty jsou funkční a v dostatečném množství.

Interní kontrola – přidává se do reakční směsi společně se specifickými primery a je přítomna v každém vzorku. Jako interní kontrolu používáme např. úsek genu pro 16S rRNA (detekuje přítomnost jakékoli bakteriální DNA). V případě, že metodou PCR není detekován hledaný specifický gen, ale ve vzorku je obsažena bakteriální DNA, musí být interní kontrola pozitivní, jinak reakce neproběhla správně. Nejčastější příčinou problémů je přítomnost inhibitorů PCR (např. nukleas).

Negativní izolační kontrola – slouží k ověření kvality procesu izolace DNA. Místo vyšetřovaného bakteriálního kmene použijeme sterilní destilovanou vodu nebo, v případě že DNA izolujeme přímo ze vzorku potraviny, sterilní pomnožovací médium. Při správném provedení negativní izolační kontroly nedojde k vyizolování žádné DNA, proto také výsledek PCR reakce je negativní. Tato kontrola slouží k ověření, že vlastní postup izolace DNA není zdrojem cizorodé DNA, která by mohla následně ovlivnit výsledky PCR.