Metody izolace nukleových kyselin

Úvod

Prvním krokem v provedení genotypových metod je extrakce nukleové kyseliny a její oddělení od ostatních složek buňky.

Může se izolovat:

• chromosomální DNA,
• plazmidová DNA
• virová DNA či RNA,

Nukleová kyselina se izoluje:

• přímo ze vzorku,
• z pomnožovacího média
• z kolonií mikroorganismu na agarové půdě.

Existuje celá řada metod extrakce a purifikace nukleových kyselin. Při výběru izolační techniky se zohledňuje požadavek na kvalitu a množství nukleové kyseliny, neboť ve velké míře rozhoduje o úspěšnosti navazujících molekulárně biologických metod. Také je brána v potaz časová náročnost, finanční nákladnost metody a zdroj nukleové kyseliny (typ vzorku či druh mikroorganismu).

Kontrola kvality, kvantity a čistoty izolované DNA se provádí gelovou elektroforézou a UV spektrofotometrií.

Izolační techniky

Obecný postup získání nukleových kyselin zahrnuje narušení buněčných membrán a uvolnění buněčného obsahu, separaci nukleové kyseliny a v případě izolace DNA také odstranění RNA.

DNA lze získat např.:

• lýzou bakteriálních buněk varem
• pomocí chelatačních iontoměničových pryskyřic
• fenol-chloroformovou extrakcí
• pomocí silikátových kolonek
• pomocí magnetických částic
• vysolováním

Lýza buněk varem

Nejlevnějším způsobem izolace bakteriální DNA je lýza bakteriálních buněk varem.

Postup: Z několika kolonií čisté 24-hodinové bakteriální kultury se vytvoří suspenze ve 100 µl sterilního fyziologického roztoku (případně sterilní destilované vody). Po zahřátí suspenze mikroorganismů při 100 °C v suché lázni 15 – 20 minut je DNA uvolněna do roztoku. Po ukončení inkubace vzorek odstředíme 10 minut při 10 000 rpm.

Získaný supernatant použijeme do PCR reakce jako templátovou DNA.

Chelatační iontoměničové pryskyřice

Dále se mohou používat chelatační iontoměničové pryskyřice. Izolace je založena na iontové vazbě molekuly DNA na nabitý iontoměnič v roztoku či na membráně, promytí a uvolnění DNA do roztoku.

Tato metoda je velmi rychlá a díky komerčně dostupným kitům i rozšířená.

Jako vzorek DNA se používá supernatant.

Fenol-chloroformová extrakce

Jednou z nejstarších, avšak stále používaných, metod izolace DNA je fenol-chloroformová extrakce.

Tato metoda je velmi levná a výtěžky DNA jsou vyšší a stabilnější, než které poskytují komerční izolační kity. Nevýhodou je práce s fenolem a chloroformem, kvantita i kvalita získané nukleové kyseliny závisí na přesnosti provedení práce a je časově velmi náročná. Není proto vhodná pro laboratoře s velkým množstvím vzorků.

Silikátové kolonky

V dnešní době se pro izolaci DNA používají velmi oblíbené silikátové kolonky.

Jejich výhodou je časová i pracovní nenáročnost a získání poměrně čisté DNA.

Tato technika je založená na principu afinitní chromatografie. DNA má v přítomnosti chaotropních solí schopnost vázat se na silikátový povrch. Při promývání a odstraňování ostatních složek buněčného lyzátu, které volně prochází kolonkou, DNA zůstává adherována až do použití elučního pufru, poté se uvolní.

Magnetické částice

K izolaci nukleových kyselin se mohou použít také magnetické částice, které se přidají k hrubému lyzátu.

Povrch těchto paramagnetických nosičů je upravený tak, aby mohl dočasně vázat vlákna nukleových kyselin a pomocí magnetu je separovat od ostatních složek buňky.

Technika vysolování

Technika vysolování je založena na změně rozpustnosti molekul DNA v závislosti na změně koncentrace iontů v roztoku.

Používá se např. síran amonný, chlorid sodný.