Agarózová gelová elektroforéza (ELFO)

Horizontální agarózová gelová elektroforéza

K vyhodnocení výsledků polymerázové řetězové reakce (PCR produktů, amplikonů) mohou být použity různé metody. Např. hybridizace, ELISA nebo sekvenční analýza.

Avšak snadná, levná a asi nejužívanější je separace amplikonů pomocí horizontální agarózové gelové elektroforézy (ELFO).

PCR produkty migrují agarózovým gelem na základě jejich záporného náboje od katody ke kladně nabité anodě a rychlost pohybu molekul DNA je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti.

Příprava agarózového gelu

Podle požadované koncentrace agarózového gelu (obvykle 1,5 – 3%, záleží na velikosti PCR produktu) se naváží potřebné množství agarózy a k ní přidá 0,5× koncentrovaný TBE pufr (tris-EDTA-borátový pufr).

Agaróza se rozvaří v mikrovlnné troubě,opakovaně zahřeje k varu a promíchává až do úplného rozpuštění.

Pak se nechá agaróza zchladit asi na 45 °C a poté se nalije do připravené vaničky. Do agarózy se vsune hřebínek, který se nesmí dotýkat dna vaničky a nechá se na vodorovné ploše ztuhnout při laboratorní teplotě.

Ze ztuhlého gelu se opatrně vysune hřebínek, nesmí při tom dojít k poškození gelu.

ELFO - nanášení vzorků

1) Připravený gel se vloží do elektroforetické vany a zalije 0,5× TBE pufrem. Celý gel musí být ponořen, hladina TBE pufru by měla být 1 – 2 mm nad gelem.

2) Druhou možností je nanášení vzorků do gelu tzv. „na sucho“ mimo elektroforetickou vanu.

Gel s nanesenými vzorky poté vložíme do elektroforetické vany a zalijeme 0,5× TBE pufrem, pufr musíme nalévat velmi opatrně, aby nedošlo k vyplavení vzorků z jamek.

Do jamek gelu se nanáší po 10 μl PCR amplifikované reakční směsi, a to jednotlivé vzorky i pozitivní a negativní kontrolu.

Pokud se nepoužívá barevná polymeráza s vkládacím pufrem, musí se před nanesením PCR produkt smíchat v poměru 1:5 s vkládacím pufrem, který obsahuje stabilizační složky a látku (barvivo) pro zviditelnění přibližné migrace DNA gelem.

Do jedné jamky gelu se nanese DNA marker.

Marker je velikostní standard, obsahující různě dlouhé fragmenty DNA s přesně definovaným počtem páru bazí. Používá se při agarózové gelové elektroforéze k odhadu velikostí PCR produktů na základě jejich pohyblivosti v agarózovém gelu.

Elektroforetická vana

Elektroforetická vana, ve které je vložen agarózový gel s PCR produkty, je připojena ke zdroji elektrického napětí.

Vizualizace a analýza PCR produktů

Po ukončení elektroforézy se přenese gel do misky s roztokem ethidium bromidu a nechá se barvit (asi 10 minut), aby se mohla identifikovat poloha PCR produktů, které nejsou pouhým okem viditelné.

Ethidium bromid je látka interkalující se (vmezeřující se) mezi sousední páry bází v DNA.

Pozor! Ethidium bromid je mutagenní a teratogenní látka, proto veškerou manipulaci s ním či obarveným gelem se provádí v ochranných rukavicích!

Po obarvení se gel opláchne v misce s vodou, abych se vymyl přebytek DNA barviva, a prohlíží se na transiluminátoru pod UV světlem. Ethidium bromid fluoreskuje oranžově.

V některých laboratořích se ethidium bromid přidává přímo do agarózového gelu při jeho přípravě. Při tomto způsobu se vzniklé PCR produkty barví již během elektroforézy, po jejímž ukončení je možné ihned vyhodnotit výsledky. Nevýhodou je velké množství pomůcek kontaminovaných ethidium bromidem a mnohem vyšší nároky na bezpečnost práce.

Bezpečnější alternativou je barvení PCR produktů pomocí látky Midori Green, která emituje zelenou fluorescenci.

Velikost PCR produktu je v určitém velikostním rozmezí a udává se v párech bazí (bp). K odhadu velikostí DNA produktů generovaných v PCR se používá DNA marker s fragmenty o známé velikosti, a to na základě srovnání jejich pohyblivosti.

Příklad vyhodnocení PCR produktů pomocí ELFO

Na obrázku je vyfocený gel, ve kterém jsou detekovány PCR produkty.

Gel má 5 jamek. Do jamky 1 až 4 byly napipetovány PCR produkty (1 - negativní kontrola, 2 - pozitivní kontrola s DNA kmene Lactobacillus brevis, 3 a 4 - analyzovaný vzorek), do 5. jamky byl napipetován hmotnostní standard (DNA marker - obsahuje DNA fragmenty o známé velikosti).

PCR produkty i DNA marker migrovaly gelem a na základě velikosti se rozdělily (kratší fragmenty DNA migrovaly rychleji - doputovaly dál - na fotce níž; delší fragmenty migrovaly pomaleji a doputovaly do kratší vzdálenosti od jamek - na fotce výš).

PCR produkty jsou po obarvení a ozáření UV světlem viditelné jako tenká čára, tzv. band.

Závěr:

1) negativní kontrola je v pořádku - žádný amplikon v průběhu PCR nevznikl (komponenty nebyly zkontaminovány), žádný band není pozorovatelný

2) pozitivní kontrola je v pořádku (všechny komponenty byly funkční) - vznikl amplikon o velikosti 1340 bp

3) neznámý izolát je Lactobacillus brevis - vzniklý amplikon je porovnán s DNA markerem, případně pozitivní kontrolou, velikost odpovídá 1340 bp

4) neznámý izolát je Lactobacillus brevis - vzniklý amplikon je porovnán s DNA markerem, případně pozitivní kontrolou, velikost odpovídá 1340 bp

5) fragmenty DNA u hmotnostního standardu byly rozděleny podle délky (počtu páru bazí bp)