Modifikace PCR

Modifikace PCR

Modifikací polymerázové řetězové reakce vznikla v průběhu let řada, některé z nich jsou dokonce využitelné i při typizaci (tzv. fingerprinting) jednotlivých izolátů mikroorganismů (např. REP-PCR – interrepetitivní (repetitivní) PCR či RAPD – náhodná PCR).

Multiplex-PCR

Mezi běžně používané patří mnohonásobná multiplex-PCR, která umožňuje detekci více genů současně.

Podle počtu požadovaných PCR produktů (amplikonů), obsahuje master mix příslušný počet párů primerů.

Tato metoda se často využívá pro stanovení několika bakteriálních druhů současně (např. Campylobacter jejuni a C. coli) nebo při detekci genů kódujících stafylokokové enterotoxiny či genů rezistence.

Real-time PCR

Další významnou modifikací je real-time PCR (qPCR) – metoda umožňující přímou detekci a kvantifikaci PCR produktu „v reálném čase“ (v průběhu celé PCR reakce), nikoliv až po jeho skončení.

Při stanovení PCR produktů se využívá sledování fluorescenčního signálu, jeho intenzita je permanentně snímána a analyzována speciálním přístrojem, ve kterém současně probíhá vlastní PCR.

K detekci lze využít:

• fluorescenční barviva fluoreskující po vazbě na dsDNA (např. SYBR^® Green I),
• fluorescenčně značené hybridizační sondy, které se komplementárně vážou na vnitřní část amplifikované sekvence,
• fluorescenčně značené primery.

Díky tomu, že se vzniklé PCR produkty nemusí detekovat elektroforeticky, je tato metoda jednodušší a rychlejší než klasická PCR.

Velkou výhodou metody real-time PCR je možnost kvantifikace množství templátu. Stanovení množství molekul nukleových kyselin ve vzorku se využívá při studiu detekce patogenních mikroorganismů a virů a také exprese genů (zejména studium transkripce – zda je a v jaké míře daný gen přepisován z DNA do mRNA).