Výhody, nevýhody a využití PCR v mikrobiologii potravin

Využití

V potravinářské mikrobiologii se polymerázová řetězová reakce využívá k rychlé detekci alimentárních patogenů přímo ze vzorku: Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Shigella spp., Campylobacter jejuni/coli, patogenní sérotypy E. coli, Vibrio spp., Yersinia enterocolitica/pseudotuberculosis, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazakii, S. aureus, Bacillus cereus, atd.

Využití nachází také při rodové konfirmaci a druhové identifikaci mnoha bakterií (např. enterokoky a další bakterie mléčného kvašení) a dále při průkazu genů kódujících faktory virulence, genů rezistence k antimikrobiálním látkám a genů zodpovědných za tvorbu enterotoxinů, biogenních aminů či bakteriocinů.

Identifikace růstově náročných mikroorganismů

Molekulárně biologické metody mohou být použity i při identifikaci pomalu rostoucích či velmi obtížně kultivovatelných mikroorganismů, čímž významně zvýšily kvalitu jejich identifikace. 

Detekce virů

Problémem při detekci alimentárních virů je to, že mohou být detekovány i inaktivované virové částice, které již nepředstavují žádné riziko. Jejich nukleová kyselina může v potravinové matrici přetrvat i po narušení funkce kapsidy viru. V takové formě ztrácí viry schopnost vázat se na hostitelskou buňku.

Další využití

Dále se metodami molekulární biologie mohou detekovat alergeny či geneticky modifikované organismy.

Výhody x nevýhody PCR

Ve vzorcích potravin se obvykle patogenní mikroorganismy vyskytují v nízkých počtech a při jejich průkazu standardními metodami je nutné je nejprve pomnožit, čímž se prodlužuje doba identifikace.

Využití PCR tedy významně zkracuje potřebnou dobu stanovení.

Na druhou stranu, stejně jako u jiných alternativních metod, musí být pozitivní výsledek (průkaz patogenního mikroorganismu přímo ve vzorku) potvrzen standardní kultivační metodou.

Metoda PCR se může přímo využít k detekci mikroorganismů, avšak nestanovíme jí přítomnost toxinů a dalších metabolitů schopných ovlivnit bezpečnost potravin (např. stafylokokové enterotoxiny). Stanoví se pouze geny kódující tyto látky nebo jejich exprese.

Citlivost PCR je tak vysoká (umožňující detekci jediné buňky), že u kontaminovaných vzorků se mohou vyskytnout falešně pozitivní reakce. Naopak v přítomnosti kontaminujících látek, které PCR inhibují, může dojít k falešně negativní reakci.

Některé molekulární techniky jsou poměrně nákladné, časově náročné a pracné, a proto nejsou vždy vhodné pro rutinní identifikaci.

Inhibitory PCR

Teoreticky umožňuje technika PCR detekovat jednu jedinou buňku či molekulu DNA. Avšak správný průběh reakce může být narušen přítomností celé řady inhibitorů. Zejména potravinová matrice se vyznačuje jejich velkým množstvím.

Za snížení citlivosti či úplné selhání reakce mohou být zodpovědné bakteriální enzymy (nukleasy, proteasy), polysacharidy, proteiny, lipidy a další složky potravin (např. ionty Ca²⁺ u mléčných výrobků, myoglobin u masných výrobků), pudr z laboratorních rukavic, složky kultivačních médií, detergenty, antibiotika, aj.

Již při izolaci nukleové kyseliny může dojít k selhání buněčné lýzy nebo degradaci templátové DNA či RNA. Poškozeny mohou být také primery (zejména ty s nižší teplotou tání), případně může dojít k obsazení jejich cílových míst. Termostabilní DNA-polymerasu mohou inhibitory inaktivovat. K inhibici dojde snáze, pokud je nízká koncentrace templátové nukleové kyseliny a pokud se tvoří dlouhý amplikon nebo amplikon s nižším obsahem G+C bazí. U real-time PCR může být inhibován také fluorescenční signál. Tyto nežádoucí vlivy se mohou projevit jako falešně negativní výsledek.