Základní testované biochemické vlastnosti

Úvod

Pro průkaz biochemické aktivity byla vyvinuta celá řada různých biochemických identifikačních testů, kterými detekujeme přítomnost produktů či metabolitů vznikajících utilizací sacharidů, bílkovin či dalších látek nebo přímo vybrané enzymy, specifické pro daný druh bakterií (např. β-D-glukuronidasa u Escherichia coli).

Diagnostika pozitivní biochemické reakce je založena na změně barvy testovacího média, ke které dochází změnou příslušného indikátoru. Dříve se proto soubor biochemických testů označoval jako tzv. pestrá řada (např. pestrá řada cukrů).

Průkaz tvorby sirovodíku

Sirovodík (sulfan) vzniká postupným odbouráváním aminokyselin obsahujících síru (methionin, cystein).

K detekci se používá půda s glukosou a solemi železa nebo jiných těžkých kovů (Pb, Bi) nebo, při použití cystinového bujónu, papírek napuštěný octanem olovnatým.

V pozitivním případě vzniklý sirovodík reaguje s ionty železa a vzniká tmavošedý až černý sulfid železa. Podobně je tomu při použití jiných kovů, např. olova (vzniká sulfid olovnatý).

Reakce je typická pro většinu salmonel a rod Proteus, naopak Escherichia coli dává reakci negativní.

Průkaz přítomnosti katalasy

Většina aerobních a fakultativně anaerobních bakterií tvoří enzym katalasu (peroxidasu), který rozkládá pro bakterie toxický peroxid vodíku na vodu a kyslík.

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂

Z grampozitivních bakterií je pozitivní reakce typická pro rody Staphylococcus či Bacillus, negativní průkaz je u bakterií mléčného kvašení (např. rody Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus) či Clostridium. Převážná většina gramnegativních bakterií je katalasapozitivní (např. čeleď Enterobacteriaceae).

Průkaz přítomnosti katalasy - provedení

Pracovní postup:

• Na čisté podložní sklíčko kápneme čerstvě připravený 3% roztok peroxidu vodíku.
• Sterilní bakteriologickou kličkou odebereme z agarové půdy izolovanou kolonii testovaného kmene a suspendujeme ji v kapce peroxidu vodíku.
• K testování použijeme 24-hodinovou kulturu.
  

Vyhodnocení: sledujeme, zda dochází k uvolňování bublinek kyslíku.

Průkaz oxidasy a cytochromoxidasy

Oxidasa a cytochromoxidasa jsou enzymy podílející se na oxidativních procesech v bakteriální buňce a jsou přítomny u všech aerobních bakterií s respiratorním metabolismem.

Jejich průkaz je založen na oxidaci a barevné změně oxidačního činidla, ke kterému je přidána zkoušená bakteriální kultura. Enzym oxidasa je detekován barevnou reakcí N,N-dimethyl-1,4-fenylendiaminu s α-naftolem za vzniku indolfenolové modři.

Reakce je významná pro diferenciaci gramnegativních bakterií, z nichž většina je oxidasapozitivní. Negativní průkaz je u fermentujících bakterií z čeledi Enterobacteriaceae.

Průkaz oxidasy a cytochromoxidasy - provedení

Pracovní postup:

• Sterilní bakteriologickou kličkou odebereme z agarové půdy dobře izolovanou kolonii testovaného kmene a vetřeme ji do impregnované zóny testovacího proužku.
• V případě čisté kultury můžeme zónu proužku otisknout přímo na bakteriální kulturu na misce.
• K testování použijeme 24-hodinovou kulturu.

Vyhodnocení: V pozitivním případě dochází do jedné minuty k modrému zbarvení oxidasového testu nebo do dvou minut k červenofialovému zbarvení u cytochromoxidasového testu.

Film: OXI test

Průkaz tvorby indolu

Test slouží k průkazu tvorby indolu z aminokyseliny tryptofanu.

Jeho tvorba je závislá na zvýšeném obsahu tryptofanu v médiu a vyžaduje nepřítomnost glukosy.

Přítomnost indolu se indikuje přídavkem Kovácsova činidla (p-dimethylaminobenzaldehydu).

V pozitivním případě vzniká sytě růžový až červený reakční produkt, negativní reakce je charakterizována světle žlutohnědým zbarvením.

Reakce je typická pro Escherichia coli, naopak Salmonella spp. dává negativní reakci.

Průkaz tvorby indolu a přítomnosti β-D-glukuronidasy (COLI test)

COLItest slouží k průkazu enzymu ß-D-glukuronidasy a tvorby indolu z aminokyseliny tryptofanu, tedy k rychlé identifikaci izolátů Escherichia coli.

Enzym ß-D-glukuronidasa štěpí 4-methylumbelliferyl-ß-D-glukuronid, vzniklý  4-methylumbelliferon vykazuje pod UV modrou fluorescenci.

Pracovní postup:

• Čistou kulturu testovaného kmene homogenizujeme v 1 ml sterilního fyziologického roztoku ve zkumavce tak, aby vzniklý zákal odpovídal 3. stupni McFarlandovy zákalové stupnice.
• Zkumavku inkubujeme v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin.
• K testování použijeme 24-hodinovou kulturu.

Vyhodnocení: Po uplynutí inkubační doby nejprve pozorujeme na transiluminátoru při UV 360 nm tvorbu modré fluorescence. Poté přikápneme do zkumavky 4 – 5 kapek Kovácsova činidla a hodnotíme výsledné zbarvení ve zkumavce (růžový prstenec na povrchu).

COLI test - provedení

Průkaz tvorby indolu a aktivity β-D-glukuronidázy (COLI test)

Průkaz glykosidas

Pestrá řada cukrů slouží ke sledování schopnosti mikroorganismů využívat různé druhy cukrů.

Nejčastěji se testuje schopnost utilizovat glukosu, laktosu, sacharosu, ribosu, dále trehalosu, sorbitol, rhamnosu, inositol, manitol, rafinosu, atd.

K průkazu se používají tekuté půdy obsahující vždy určitý cukr a indikátor pH (bromthymolová modř, bromkrezolový purpur, fenolová červeň).

V pozitivním případě dochází zkvašováním substrátu ke tvorbě organických kyselin, které okyselují médium a způsobí změnu indikátoru (půda zežloutne), vytvoří se zákal, blanka či sediment. Při použití plynovky můžeme současně prokázat také tvorbu plynu (bublina v plynovce).

Průkaz glykosidas - provedení

Pracovní postup:

• Připravené bujony rozplňujeme po 10 ml do zkumavek a před přidáním cukrů sterilizujeme v Kochově přístroji, cukry jsou sterilizovány filtrací.
• Do zkumavek s glukosovým, příp. laktosovým bujonem přidáme sterilní skleněnou plynovku.
• Sterilní bakteriologickou kličkou nabereme čistou kulturu testovaného mikroorganismu a zaočkujeme ji do zkumavek s cukernými bujony.
• K očkování lze použít i suspenzi testovaného mikroorganismu ve sterilním fyziologickém roztoku.
• K testování použijeme 24-hodinovou kulturu.
• Naočkované zkumavky inkubujeme při 37 °C po dobu 24 – 48 h.

Film: průkaz zkvašování glukosy

Růst na TSI agaru (Triple Sugar Iron agar, Hajnův agar)

Agar podle Hajny obsahuje tři základní cukry – glukosu, laktosu, sacharosu, a železité soli.

Enzymatickou činností mikroorganismů dochází ke změně původně červené barvy média na žlutou, a to v různém rozsahu dle spektra využívaných cukrů. Současně lze sledovat produkci plynu a tvorbu sirovodíku.

Příprava agaru: TSI agar se připravuje jako šikmý agar s vyšším klínem. Jednotlivé cukry jsou na základě své molekulové hmotnosti rozděleny následovně: dole sacharosa, uprostřed glukosa a v horním klínu laktosa. Toto rozdělení umožňuje dobře rozpoznat zkvašování jednotlivých cukrů. Indikátorem štěpení je fenolová červeň.

Postup:

• Očkování testované bakteriální kultury se provádí vpichem do agarového sloupce a následně hadovitým rozočkováním po povrchu klínu.
• K testování použijeme 24-hodinovou kulturu.
• Naočkované zkumavky inkubujeme při 37 °C po dobu 24 – 48 hodin.

Vyhodnocení: Po ukončení inkubace hodnotíme změnu barvy kultivační půdy, tvorbu plynu (potrhání agaru) a tvorbu sirovodíku (černání kolem vpichu způsobené reakcí sirovodíku s ionty železa za tvorby černého sulfidu železitého). Zkvašuje-li mikroorganismus (např. salmonely a shigely) pouze glukosu, zežloutne jen sloupec a šikmá plocha zůstane červená (horní šikmá část půdy se oxidativní dekarboxylací aminokyselin z peptonu alkalizuje, proto červená). Pokud testovaný mikroorganismus (např. E. coli, enterobakter) zkvašuje současně s glukosou i laktosu či sacharosu, příp. všechny tři cukry, zežloutne sloupec i šikmá plocha (vytvoří se tak velké množství kyseliny, že alkalizace šikmé části neproběhne).

TSI agar - provedení

Průkaz β-galaktosidasy (ONPG-test)

Test je zaměřen na průkaz enzymu β-galaktosidasy, který mikroorganismy potřebují při fermentaci laktosy. Jeho tvorba je detekována pomocí syntetického substrátu o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosidu (ONPG).

V pozitivním případě dochází účinkem enzymu k uvolnění žlutě zbarveného nitrofenolu, při negativní reakci zůstane roztok bezbarvý.

Reakce je významná pro rozlišení rodů v čeledi Enterobacteriaceae; je pozitivní i u rodů, které laktosu zkvašují opožděně (např. Citrobacter spp.). Lze tedy rozlišit salmonely (negativní) od citrobakterů či E. coli (pozitivní).

Postup: 

• Čistou kulturu testovaného kmene homogenizujeme v 0,6 ml sterilního fyziologického roztoku ve zkumavce tak, aby vzniklý zákal odpovídal 2. stupni McFarlandovy zákalové stupnice.
• Do připravené suspenze vložíme diagnostický proužek (papírová zóna proužku musí být zcela ponořena).
• Zkumavku inkubujeme v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin (enterobakterie), pro gramnegativní nefermentující bakterie se doporučuje teplota 30 °C po dobu 48 hodin.
• K testování použijeme 24-hodinovou kulturu.

Vyhodnocení: Po uplynutí inkubační doby hodnotíme výsledné zbarvení ve zkumavce.