Stanovení koliformních bakterií

Charakteristika koliformních bakterií

Koliformní bakterie jsou aerobní nebo fakultativně anaerobní gramnegativní nesporulující tyčinky zkvašující laktózu s tvorbou kyseliny a plynu při teplotě 30 °C do 48 hodin. Patří do čeledi Enterobacteriaceae; některé kmeny mohou být patogenní (např. některé sérotypy E. coli).

Koliformní bakterie jsou součástí střevní mikroflóry člověka a teplokrevných zvířat, současně se vyskytují i ve vnějším prostředí. V potravinářské mikrobiologii mají význam jako indikátor fekálního znečištění a tím také možné přítomnosti patogenních mikroorganismů pocházejících ze zažívacího traktu. Přímou kontaminaci potravin koliformními bakteriemi pocházejícími z výkalů lze selektivně prokázat kultivací při zvýšené teplotě 44,5 °C. Koliformní bakterie dále slouží jako indikátor dodržení sanitačních a technologických postupů, jsou ukazatelem úrovně hygieny. Jejich výskyt v pasterovaných výrobcích je známkou sekundární kontaminace nebo hrubých závad při tepelném ošetření. Význam mají některé psychrotrofní kmeny (aktivní i při nízkých teplotách) a termorezistentní formy odolávající tepelnému ošetření.

Stanovení v potravinách

Na stanovení koliformních bakterií byla vypracována řada metod. Lze je stanovit mikrobitesty, kultivačně v tekutých či pevných půdách nebo na membránových filtrech.

Obecně je průkaz koliformních bakterií založen na použití selekčních činidel potlačujících růst grampozitivních bakterií (např. žlučové soli, krystalová violeť, briliantová zeleň) a indikátorů zkvašování laktózy (indikátor pH, tvorba plynu).

Pro stanovení koliformních bakterií v potravinách byla zvolena kultivační teplota 30 °C. Lze použít i teplotu 37 °C, je-li stanovení prováděno v souvislosti s ochranou veřejného zdraví. Naopak pro stanovení kmenů výhradně střevního původu se používá teplota 44,5 °C, při které ostatní kmeny koliformních bakterií nerostou – jedná se o tzv. termotolerantní koliformní bakterie.

Vlastní stanovení se provádí buď s předpomnožením vzorku v tekutém médiu nebo bez předpomnožení, podle očekávaného počtu mikroorganismů se volí metoda nejvýše pravděpodobného počtu nebo plotnová metoda.

Film: průkaz zkvašování laktosy

Princip metody

Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se zalévá agarovou živnou půdou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučovými solemi a laktózou (VČŽL agar, angl. VRBL agar). Inokulované plotny se inkubují aerobně při 30 °C po dobu 48 hodin. Z počtu suspektních kolonií vyrostlých na vybraných miskách se vypočte počet koliformních baktérií v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Pracovní postup

• Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.

• Vzorky očkujeme vždy jinou sterilní pipetou po 1 ml souběžně do dvou sterilních řádně označených Petriho misek.

• Inokulum v každé Petriho misce přelijeme asi 10 ml VČŽL agaru vytemperovaného na 45 ± 2 °C, důkladně krouživým pohybem promícháme a necháme utuhnout na chladné vodorovné ploše. Předpokládáme-li přítomnost mikroorganismů vytvářejících povlaky, přelijeme po utuhnutí agar na misce asi 15 ml téže půdy (již nemícháme, pouze převrstvíme!).

• Po ztuhnutí agarové půdy Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin.

Hodnocení výsledků a konfirmace

První odečítání provádíme po 24 hodinách, výsledný počet se zjistí po ukončení inkubace, tj. po 48 hodinách. Počítáme charakteristické kolonie narostlé na každé misce. Pro výpočet použijeme misky obsahující 10 – 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Počet koliformních baktérií vyjádříme jako počet KTJ v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

Po 48 hodinách kultivace mají kolonie narostlé na VČŽL agaru následující morfologii:

• uvnitř půdy – kolonie fialově červené barvy o průměru 0,5 – 2 mm, někdy obklopené červenou zónou precipitované žluče;

• na povrchu půdy – kolonie fialově červené barvy o průměru 1 – 3 mm, kolonie mají často světlejší bezbarvý okraj, většina kmenů tvoří v půdě pod koloniemi růžový precipitát.