Stanovení mezofilních bakterií mléčného kvašení

Charakteristika mezofilních bakterií mléčného kvašení

Mezi bakterie mléčného kvašení (BMK) patří celá řada rodů, jako např. laktokoky, enterokoky, streptokoky, leukonostoky, pediokoky. Nejpočetnějším a nejvýznamnějším rodem BMK je rod Lactobacillus z čeledi Lactobacillaceae. Laktobacily jsou grampozitivní nesporulující a většinou nepohyblivé tyčinky až kokobacily vyskytující se v palisádách či řetízcích. Jsou velmi nutričně náročné a nemají ani katalázovou ani oxidázovou aktivitu. Laktobacily jsou fakultativně anaerobní či mikroaerofilní bakterie se striktně fermentativním metabolismem.

Zástupci tohoto rodu se mohou dělit podle svého metabolismu a zkvašování sacharidů na obligátně homofermentativní (hexosy zkvašují pouze na kyselinu mléčnou; pentosy ani glukonát nezkvašují; např. L. delbrueckii, L. acidophilus), fakultativně heterofermentativní (hexosy zkvašují na kyselinu mléčnou nebo směs kyseliny mléčné, octové, mravenčí a ethanolu; pentosy na kyselinu mléčnou a octovou; např. L. plantarum, L. casei) a obligátně heterofermentativní (hexosy zkvašují na kyselinu mléčnou, octovou a CO₂; pentosy na kyselinu mléčnou a octovou; např. L. fermentum, L. kefiri). V dnešní době se však preferuje rozdělení laktobacilů podle jejich fylogenetické příbuznosti.

Laktobacily se přirozeně vyskytují v mléce, na rostlinách, v silážích, v půdě i vodě, v ústech a trávícím traktu savců a ptáků a jsou součástí vaginální mikroflóry člověka. Pro potravinářský průmysl mají laktobacily značný význam. Jejich činnosti je využíváno pro konzervaci zeleniny a některých krmiv (tvorba kyselin, bakteriocinů a nízkého pH), při výrobě sýrů (L. helveticus, L. delbrueckii, L. casei) a kysaných mléčných výrobků (L. delbrueckii, L. kefiri, L. plantarum), některých druhů masných výrobků, atd. Na druhou stranu kontaminace heterofermentativními mléčnými baktériemi způsobuje problémy při výrobě uzenin, a to zelenání prátu a hotových výrobků. Laktobacily se vyznačují také proteolytickou a slabou lipolytickou aktivitou. Mohou tvořit biogenní aminy a vzácně být i patogenní.

Stanovení v potravinách

Půdy určené pro stanovení mezofilních bakterií mléčného kvašení jsou nutričně obohacené kvasničným extraktem, glukózou a Tweenem 80 (zdroj mastných kyselin). Růst ostatních mikroorganismů je potlačen přítomností inhibičních složek (citrát amonný, octan sodný) a nízkým pH média (pH 5,7). Pro stanovení počtu mezofilních bakterií mléčného kvašení se používá plotnová metoda s aerobní, mikroaerofilní či anaerobní kultivací při 30 °C.

Princip metody

Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se zalévá agarovou živnou půdou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen De Man, Rogosa a Sharpe agar (MRS agar) o pH 5,7. Inokulované plotny se inkubují aerobně při 30 °C po dobu 72 hodin. Lze použít i techniku očkování na povrch půdy  roztěrem v kombinaci s inkubací za anaerobních nebo mikroaerofilních podmínek. Stanoví se počet mikroorganismů v 1 ml nebo 1 g vzorku z počtu kolonií vyrostlých na vybraných miskách.

Upozornění: V některých potravinářských výrobcích se vyskytují psychrotrofní nebo termofilní bakterie mléčného kvašení vyžadující kultivační teplotu jinou než 30 °C, kromě toho na agaru MRS při pH 5,7 nerostou všechny bakterie mléčného kvašení a některé rostou pouze slabě.

Pracovní postup

• Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.

• Vzorky očkujeme vždy jinou sterilní pipetou po 1 ml souběžně do dvou sterilních řádně označených Petriho misek.

• Inokulum v každé Petriho misce přelijeme asi 15 ml MRS agaru vytemperovaného na 45 ± 2 °C, důkladně krouživým pohybem promícháme a necháme utuhnout na chladné vodorovné ploše.

• Po ztuhnutí agarové půdy Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin.

• Alternativní metoda: Vzorek lze očkovat roztěrem na povrch MRS agaru, a to 0,2 ml inokula souběžně do dvou řádně označených Petriho misek. Naočkované plotny inkubujeme za anaerobních či mikroaerofilních podmínek.

Hodnocení výsledků a konfirmace

Po ukončení inkubace spočítáme kolonie narostlé na každé misce. Pro výpočet použijeme misky obsahující 10 – 300 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Protože za uvedených podmínek mohou na MRS agaru růst i jiné mikroorganismy než baktérie mléčného kvašení, je vhodné získané kolonie jednoduchým způsobem konfirmovat (Gramovo barvení, test na průkaz katalázy). Počet mezofilních baktérií mléčného kvašení vyjádříme jako počet KTJ v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

Po 3 dnech kultivace na MRS agaru jsou kolonie mezofilních baktérií mléčného kvašení pravidelné, okrouhlé, hladké, spíše bezbarvé o průměru 0,5 – 2 mm, charakteristickým znakem je nakyslý zápach.