Kultivační média

Druhy kultivačních půd

Obecně dělíme kultivační půdy na půdy přirozené (komplexní, chemicky nedefinované), jejichž základem je živný bujón, a syntetické (chemicky definované), které jsou složeny z chemicky definovaných sloučenin. Mezistupeň tvoří kultivační půdy neúplně chemicky definované, které jsou částečně složeny z přírodních surovin a částečně z chemických látek, tyto mají v mikrobiologii potravin největší zastoupení.

Dále rozlišujeme půdy k přímému použití (angl. ready-to-use medium), které jsou výrobcem dodávány v Petriho miskách nebo zkumavkách, a půdy připravené v laboratoři, a to z komerčních dehydrovaných směsí nebo z jednotlivých složek podle receptury.

Podle konzistence rozeznáváme půdy tekuté (bujony) a půdy pevné (agary). Pevné půdy se připravují ztužením bujonového základu přidáním 1 – 2 % agaru, což je směs polysacharidů extrahovaných z rudých mořských řas – agarofytů. V některých případech (např. stanovení pohyblivosti, serologické určení bičíkových antigenů) se používají i půdy polotuhé (semisolidní) s přídavkem agaru do 0,5 %.

Dále dělíme kultivační půdy podle jejich složení a účelu použití.

Obrázek: Základní tekutá půda (bujon) - pufrovaná peptonová voda

Dělení kultivačních půd podle složení - 1

Podle složení dělíme kultivační půdy do následujících skupin:

- základní půda je tvořena pouze neobohaceným jednoduchým živným základem. Rozlišujeme půdy tekuté (živný bujon, peptonová voda) a pevné (živný agar).

- obohacená půda – základ půdy se připravuje z kvalitnějších extraktů (např. mozkosrdcová infuze) a obohacuje se bílkovinnými koncentráty a hydrolyzáty, peptony, dále např. škrobem, vejci, krví či cukry. Rozlišujeme půdy tekuté (např. mozkosrdcová infuze) a pevné (např. krevní agar, čokoládový agar, agar s glukosou, tryptonem a kvasničným extraktem).

- elektivní (výběrová) půda je svým složením podobná základním médiím, obsahuje však některé komponenty vztahující se k určité charakteristické společné vlastnosti taxonomicky odlišných druhů. Elektivní půdy se používají pro stanovení proteolytických (např. agar s odstředěným mlékem, agar s želatinou), lipolytických (např. agar s tweenem, agar s želatinou a tweenem) či sacharolytických bakterií (např. agar obohacený škrobem).

- selektivní půda slouží pro kultivaci úzké taxonomické skupiny mikroorganismů, růst průvodní nežádoucí mikroflóry je zde potlačen. Obecně se skládá ze živného základu a inhibitoru růstu nežádoucích mikroorganismů. Rozlišujeme tekuté půdy (např. půda s malachitovou zelení – pro záchyt salmonel, alkalická peptonová voda) a půdy pevné (např. agar s 10 % NaCl pro záchyt stafylokoků).

Dělení kultivačních půd podle složení - 2

- diagnostická půda – diagnostika určitého druhu mikroorganismu je založena na jeho vybraných biochemických vlastnostech podmíněných přítomností nebo tvorbou určitých enzymů. Půda obsahuje mimo živného základu i vhodný substrát (např. sacharidy, aminokyseliny) a indikátor biochemické aktivity (např. indikátor změny pH). Rozlišujeme půdy tekuté (např. cukrové půdy, půdy pro průkaz tvorby indolu, H₂S) a pevné (např. Triple Sugar Iron agar).

- selektivně diagnostická půda kombinuje principy půd selektivních a diagnostických. Ze směsi mikroorganismů vyselektuje hledaný druh a současně potlačí nežádoucí mikroflóru, v důsledku utilizace přidaného substrátu rostou hledané mikroorganismy v morfologicky zřetelně odlišitelných koloniích. Pro gramnegativní bakterie jsou to např. Endův agar, MacConkey agar, XLD agar, pro grampozitivní bakterie např. Baird-Parker agar, Slanetz-Bartley agar, MYP agar.

- chromogenní půda představuje zvláštní typ diagnostických půd. Obsahuje tzv. chromogen, což je běžný substrát (např. cukr) s navázanou barevnou molekulou – chromoforem, samotný chromogen je bezbarvý. Mikrob chromogen absorbuje a pokud obsahuje enzym katalyzující štěpení vazby mezi substrátem a chromoforem je schopen chromogen rozštěpit a substrát zužitkovat. Uvolněný nerozpustný chromofor se hromadí v bakteriální buňce a způsobuje její typické zbarvení. Chromogenní média jsou vyvinuta pro průkaz Escherichia coli O157, salmonel, Listeria monocytogenes, enterokoků, atd.

- fluorogenní půda pracuje na podobném principu jako půda chromogenní. Na vhodný substrát je navázáno fluorescenční barvivo, které způsobuje typickou fluorescenci bakteriálních kolonií v UV světle při 360 nm. Tento typ půd se využívá např. při stanovení E. coli v pitné vodě.

Obecné složení kultivačních půd

Tabulka 1: Obecné složení některých typů kultivačních půd

Dělení kultivačních půd podle účelu použití - 1

V mikrobiologii potravin se nejčastěji setkáváme s následujícími typy kultivačních médií:

- transportní půda je půda určená k zachování životaschopnosti mikroorganismů během přepravy vzorku do laboratoře. Pro udržení dostatečné vlhkosti bývají transportní média tekutá nebo polotuhá, místo živin obsahují látky omezující množení bakterií a látky absorbující toxické produkty jejich metabolismu (např. aktivní uhlí).

- konzervační půda, někdy též udržovací půda, slouží k zachování životaschopnosti mikroorganismů po delší dobu a jejich ochraně před nepříznivými vlivy. Většinou se jedná o nutričně chudé půdy, optimálně bez přítomnosti sacharidů.

- resuscitační půda umožňuje mikroorganismům oslabeným technologickými procesy při výrobě potravin reparaci a schopnost obvyklého růstu. Jedná se o tekuté půdy, které se v mikrobiologii potravin používají při průkazu bakteriálních původců onemocnění člověka (např. pufrovaná peptonová voda při průkazu salmonel v potravinách).

Dělení kultivačních půd podle účelu použití - 2

- pomnožovací půda je tekutá kultivační půda, která svým složením poskytuje zvláště vhodné podmínky pro množení mikroorganismů. Pomnožovací půda může být selektivní – potom podporuje množení určité skupiny nebo druhu mikroorganismů a částečně nebo zcela inhibuje růst doprovodné mikroflóry (např. Rappaport Vassiliadis Soya médium, bujon podle Frasera), nebo neselektivní (např. živný bujon).

- izolační půda je obecně tuhá nebo polotuhá kultivační půda podporující růst mikroorganismů, opět může být selektivní (např. PALCAM agar) nebo neselektivní (agar s glukosou, tryptonem a kvasničným extraktem).

K dalším patří půdy diferenciační, identifikační, půdy k anaerobní kultivaci, půdy ke stanovení rezistence mikroorganismů k antibiotikům, atd.

Obrázek: Pomnožovací selektivní bujón podle Frasera se používá pro pomnožení L. monocytogenes

Příprava hotových dehydratovaných živných půd

Tradiční příprava médií spočívá ve využití ingrediencí jako např. bujonu (ve vodě rozpustné komponenty masa), masového extraktu, peptonu, kvasniční vody nebo kvasničního extraktu, krve, mléka, sójové mouky, žlučových derivátů a mnoha dalších. V současnosti však většina mikrobiologických laboratoří využívá možnost nákupu komerčně vyrobených hotových dehydratovaných půd. Jejich příprava bývá mylně podceňovaným úsekem práce v mikrobiologické laboratoři. Půdy se nejčastěji dodávají v podobě prášku (příp. tablet), ale také ve ztužené podobě přímo v lahvičkách.

Nádoby obsahující dehydratované složky nebo dehydratované kompletní půdy musí být skladovány v suchu a temnu při teplotě uváděné výrobcem, běžně při laboratorní teplotě. Všechna dehydratovaná média jsou hygroskopická a musí být uchovávána v hermeticky uzavřených obalech, tím jsou chráněna před vzdušnou vlhkostí. Při přípravě živného média proto dbáme na jejich rychlé a pečlivé uzavření. Pokud půda vykazuje známky slepení nebo tuhnutí, nesmí se již dále používat. Použití půd také vylučuje překročení doby expirace uvedené výrobcem.

Postup přípravy živných půd

Při přípravě jednotlivých půd se postupuje dle konkrétní normy nebo podle doporučení výrobce. K rehydrataci půd se používá destilovaná, případně deionizovaná voda. Předepsané množství dehydratované půdy se odváží a nasype se do poloviny potřebného objemu destilované vody ve vhodné nádobě. Zbytek vody se lije po stěnách nádoby, aby došlo k dokonalému spláchnutí prášku. Po promíchání se agarové půdy nechají asi 15 minut bobtnat, nabobtnání agaru umožní jeho snadnější rozpuštění. V případě půd připravovaných z jednotlivých složek je třeba každou složku přidat samostatně, nechat ji rozpustit a teprve poté doplnit vodou na konečný objem. Každou láhev je vždy nutno řádně označit názvem kultivační půdy, datem přípravy a podpisem osoby, která půdu připravila.

Po nabobtnání se směs dobře protřepe a rozpouští se ve vroucí vodní lázni, mikrovlnné troubě či v proudící páře. Během rozpouštění obsah promícháváme, aby nedošlo k sedimentaci částic na dno nádoby. Po dokonalém rozpuštění (na stěnách nejsou viditelné částice agaru) se médium vychladí (teplota se volí dle použitého pH-metru) a provede se úprava pH na hodnotu stanovenou normou či výrobcem. K úpravě pH se používá roztok o koncentraci 1 mol/l NaOH nebo 1 mol/l HCl. Při úpravě pH bereme v úvahu, že sterilizací v autoklávu hodnota pH poklesne zpravidla o 0,1 – 0,2. Proto některé laboratoře úpravu pH provádí až po sterilizaci. Posledním krokem přípravy však zpravidla vždy bývá sterilizace.

Sterilizace půd

Živné půdy se sterilizují autoklávováním nebo filtrací. Některé druhy půd nevyžadují sterilizaci autoklávováním, ale pouze se rozvářejí (např. Slanetz-Bartley agar), podobně některé reagencie lze použít přímo bez sterilizace. Živná média se sterilizují buď přímo v nádobách v nichž byla připravena nebo po rozplnění do zkumavek (! nikoli Petriho misek). Sterilizace autoklávováním se provádí v autoklávu nebo přístroji pro přípravu a rozplňování půd. Obecně trvá autoklávování 15 minut při 121 °C za tlaku 0,1 MPa, přičemž do doby sterilizace se nepočítá čas potřebný k docílení teploty 121 °C a následné zchlazení. Při sterilizaci objemů větších než 1 000 ml nebo při použití tlustostěnného skla se sterilizační cyklus upraví dle potřeby. Živná média lze také sterilizovat filtrací za podmínek vakua nebo přetlaku. Používají se sterilní membrány nebo filtry s póry o průměru 0,22 μm a sterilní filtrační zařízení.

Obrázek: Sterilizace kultivačního média v autoklávu

Uchovávání kultivačních médií - 1

Hotová živná média se po sterilizaci rozplňují do příslušných kultivačních nádob nebo se uchovávají přímo v lahvích a před použitím se rozehřívají (ve vodní lázni, mikrovlnné troubě či proudící páře) a temperují na teplotu 45 – 50 °C, přičemž je třeba zabránit jejich přehřátí. Rozehřátá půda by měla být spotřebována nejdéle do 4 hodin. Většinou jsou půdy v pevném stavu skladovatelné při teplotě místnosti a v temnu 1 – 2 týdny, v chladničce několik týdnů, nesmí však zmrznout. Pro delší skladování je nutno nádoby hermeticky uzavřít, Petriho misky se uchovávají obrácené dnem vzhůru a zabalené do hliníkové fólie.

U některých typů půd se před rozplněním či vlastním použitím přidávají tzv. suplementy (např. antibiotika, některé chemické látky, vaječný žloutek, beraní krev). Tyto látky jsou vesměs termolabilní a sterilizací by došlo k jejich znehodnocení. Živné médium se před přidáním suplementů zchladí asi na 47 – 50  °C. Suplementy uchovávané při chladničkových teplotách a přidávané do živného média ve větším množství (např. žloutková emulze) je nutno před vlastním přidáním vytemperovat na teplotu přibližně 50 °C. Všechny suplementy je třeba s ostatní půdou opatrně, ale řádně promíchat a následně co nejrychleji rozplnit do Petriho misek či zkumavek. U některých půd (např. pro kultivaci anaerobních bakterií) je žádoucí odstranit z půdy vzduch, což se provádí zahříváním ve vroucí vodní lázni nebo proudící páře s uvolněnými víčky nebo uzávěry nádob, které se poté opět těsně uzavřou a půda se zchladí na příslušnou teplotu.

Uchovávání kultivačních médií - 2

Tekuté nebo polotuhé živné půdy plníme sterilní pipetou nebo dávkovacím zařízením do sterilních baněk nebo zkumavek opatřených vatovými zátkami nebo víčkem. Dáváme pozor, aby nedošlo k potřísnění okraje nádoby či zátky, vzniklá agarová vrstvička je vhodným médiem pro pomnožení kontaminujících mikroorganismů ze vzduchu. Některé půdy se po rozplnění opět sterilizují.

Šikmé agary se připravují tak, že se sterilní zkumavky naplní rozpuštěnou sterilní půdou asi do 1/3 objemu, uzavřou, případně opět vysterilizují a nechají ztuhnout v šikmé poloze, přičemž horní okraj agaru se nesmí dotýkat zátky zkumavky. K přípravě šikmých agarů se běžně používají skleněné zkumavky uzavřené kovovým kloboučkem či šroubovacím víčkem. Lze použít také autoklávovatelné plastové zkumavky se šroubovacím víčkem, jejichž výhodou je menší objem spotřebované živné půdy.

Nalévání agarových ploten se provádí asepticky až po sterilizaci půdy. Půda se předem vytemperuje na 45 – 55 °C, aby po nalití do Petriho misek nedošlo ke kondenzaci vodní páry na víčku. Do sterilní Petriho misky naléváme takové množství půdy, aby vznikla vrstva nejméně 3 mm vysoká (tj. asi 15 – 20 ml na misku o průměru 9 cm). Vzniknou-li v agarové půdě vzduchové bubliny, odstraní se vyžíhanou bakteriologickou kličkou či sterilní plastovou špičkou. Připravené Petriho misky či zkumavky je nutno řádně označit názvem kultivační půdy (obvykle se používá zkratka nebo laboratoří zvolený číselný kód) a datem přípravy. Na skupinový obal (např. alobal, kterým jsou Petriho misky zabalené) uvádíme název půdy, datum a jméno pracovníka, který půdy připravil.

Uchovávávání kultivačních médií - 3

Před vlastním očkováním je nutno čerstvě připravené agarové plotny předsušit, aby nedošlo na povrchu misky k tvorbě pohyblivého vodního filmu a tím ke znehodnocení vlastního vyšetření. Při předsušení se Petriho misky v termostatu opatrně otevřou a dna i víka se položí vnitřní stranou obrácenou dolů. Tím se zamezí kontaminaci sedimentujícími mikroorganismy. Termostaty a sušárny používané k předsoušení misek je třeba pravidelně čistit a dezinfikovat.

Obrázek: Předsušování Petriho misek s agary před jejich použitím

Příklady kultivačních půd - 1

Tabulka: Příklady kultivačních půd používaných při mikrobiologickém vyšetření potravin - 1

Příklady kultivačních půd - 2

Tabulka: Příklady kultivačních půd používaných při mikrobiologickém vyšetření potravin - 2