Agarózová gelová elektroforéza (ELFO)
Kapitola popisuje metodu pomocí níž jsou vizualizovány PCR produkty.
Vizualizace a analýza PCR produktů
Po ukončení elektroforézy se přenese gel do misky s roztokem ethidium bromidu
Ethidium bromid je látka interkalující se (vmezeřující se) mezi sousední páry bází v DNA.
Pozor! Ethidium bromid je mutagenní a teratogenní látka, proto veškerou manipulaci s ním či obarveným gelem se provádí v ochranných rukavicích!
Po obarvení se gel opláchne v misce s vodou, abych se vymyl přebytek DNA barviva, a prohlíží se na transiluminátoru pod UV světlem. Ethidium bromid fluoreskuje oranžově.
V některých laboratořích se ethidium bromid přidává přímo do agarózového gelu při jeho přípravě. Při tomto způsobu se vzniklé PCR produkty barví již během elektroforézy, po jejímž ukončení je možné ihned vyhodnotit výsledky. Nevýhodou je velké množství pomůcek kontaminovaných ethidium bromidem a mnohem vyšší nároky na bezpečnost práce.
Bezpečnější alternativou je barvení PCR produktů pomocí látky Midori Green, která emituje zelenou fluorescenci.
Velikost PCR produktu je v určitém velikostním rozmezí a udává se v párech bazí (bp). K odhadu velikostí DNA produktů generovaných v PCR se používá DNA marker s fragmenty o známé velikosti, a to na základě srovnání jejich pohyblivosti.