Barvení podle Grama

Dánský lékař Christian Joachim Gram (1853-1938) objevil, že bakterie se dají rozdělit do dvou skupin na základě schopnosti či neschopnosti obarvených buněk podržet si barvivo v přítomnosti alkoholu nebo acetonu.

Podstata Gramova barvení není ani dnes přesně známa, rozhodně ale souvisí se stavbou buněčné stěny. Existující teorie:

1. stěna gramnegativních bakterií obsahuje více lipidů, předpokládá se, že alkohol v nich vytváří póry, jimiž se barevný komplex snáz vyplavuje;
2. příčinou grampozitivity je silnější vrstva peptidoglykanu, která se snad vlivem alkoholu smrští, což zpomalí únik komplexu krystalové violeti s jodem;
3. příčinou vyplavování barviva u gramnegativních bakterií může být i absence kyseliny teichoové  buněčné stěně.

Princip:

Barvení podle Grama je založeno na odlišné stavbě stěny buněk grampozitivních a gramnegativních bakterií. Rozdíl spočívá v tom, že grampozitivní bakterie po obarvení krystalovou violetí a mořením Lugolovým roztokem zadržují tento barevný komplex v buněčné stěně a použití organických rozpouštědel (např. ethanol, aceton) ho již nerozpouští, bakterie zůstávají modrofialové. U gramnegativních bakterií je tento barevný komplex při použití organických rozpouštědel ze stěny buňky vymýván a po dobarvení kontrastním barvivem (safranin nebo karbolfuchsin) zůstávají bakterie červené.

Postup:

K přípravě preparátu používáme mladé kultury mikroorganismů (24 hodin), starší kultury se již špatně barví.

Připravený a řádně fixovaný preparát:

1. přelijeme roztokem Gram I (roztok krystalové violeti), doba působení  je 20 – 30 s;
2. barvivo slijeme, ale neoplachujeme vodou;
3. přelijeme roztokem Gram II (Lugolův roztok), doba působení je 20 – 30 s, poté slijeme;
4. rychle opláchneme směsí aceton-ethanol (Gram III), oplachujeme dokud odtéká barvivo (max. 30 s) a následně opláchneme vodou;
5. preparát přes hranu sklíčka osušíme filtračním papírem a naneseme roztok Gram IV (roztok safraninu nebo karbolfuchsinu), doba působení je 1 minuta;
6. preparát opatrně opláchneme vodou a osušíme filtračním papírem přes hranu sklíčka a necháme zaschnout.

Preparát se prohlíží pod mikroskopem s imerzním objektivem. Grampozitivní  bakterie se barví modrofialově, gramnegativní bakterie se barví červeně, gramlabilní bakterie tvoří přechod mezi oběma.