Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Správný průběh reakce se prověřuje použitím několika systémů kontrol.

Pozitivní a negativní kontrola je pro sérii vzorků, interní kontrola pro individuální vzorky. Dále je nezbytné kontrolovat i proces izolace DNA – tzv. negativní izolační kontrola.

Negativní kontrola – reakční směs + PCR voda či DNA získaná z buněk jiného rodu bakterií, než testujeme. Tato kontrola slouží jako indikátor, že žádná z komponent použitých pro master mix nebyla kontaminována a že celý proces reakce včetně detekce proběhl správně.

Pozitivní kontrola – reakční směs + DNA získaná z buněk stejného rodu bakterií, jež testujeme, např. sbírkového kmenu. Tato kontrola slouží jako indikátor, že celá reakce proběhla správně a že všechny použité komponenty jsou funkční a v dostatečném množství.

Interní kontrola – přidává se do reakční směsi společně se specifickými primery a je přítomna v každém vzorku. Jako interní kontrolu používáme např. úsek genu pro 16S rRNA (detekuje přítomnost jakékoli bakteriální DNA). V případě, že metodou PCR není detekován hledaný specifický gen, ale ve vzorku je obsažena bakteriální DNA, musí být interní kontrola pozitivní, jinak reakce neproběhla správně. Nejčastější příčinou problémů je přítomnost inhibitorů PCR (např. nukleas).

Negativní izolační kontrola – slouží k ověření kvality procesu izolace DNA. Místo vyšetřovaného bakteriálního kmene použijeme sterilní destilovanou vodu nebo, v případě že DNA izolujeme přímo ze vzorku potraviny, sterilní pomnožovací médium. Při správném provedení negativní izolační kontroly nedojde k vyizolování žádné DNA, proto také výsledek PCR reakce je negativní. Tato kontrola slouží k ověření, že vlastní postup izolace DNA není zdrojem cizorodé DNA, která by mohla následně ovlivnit výsledky PCR.